Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi
Summary
Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC’ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.
Abstract
Redoks dengesi hücresel homeostazın korunmasında önemli bir role sahiptir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi, proteinlerin, lipitlerin ve DNA’nın modifikasyonunu teşvik eder ve bu da sonunda hücresel fonksiyonda ve hücre ölümünde değişikliğe yol açabilir. Bu nedenle, hücrelerin zararlı hakaretlere yanıt olarak, Keap1 / Nrf2 gibi bir antioksidan yolu aktive ederek veya redoks temizleyicilerini (A, C ve E vitaminleri, β-karoten ve polifenoller, diğerleri arasında) geliştirerek antioksidan savunmalarını arttırmaları faydalıdır. Enflamasyon ve oksidatif stres, diyabetik retinopati (DR) ve prematüre retinopatisi (ROP) gibi retinopatilerin patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynar. Müller glial hücreler (MGC’ler) nöral retina dokusunun homeostazında önemli bir rol oynadığından, bu hücresel koruyucu mekanizmaları incelemek için ideal bir model olarak kabul edilirler. Bu anlamda, ROS seviyelerinin tekrarlanabilir ve basit bir yöntemle ölçülmesi, antioksidan hücre savunma mekanizmasına katılan yolların veya moleküllerin katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu makalede, MGC’lerde DCFH-DA probu ve akış sitometrisi ile ROS ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunuyoruz. yazılım ile akış sitometrisi veri işleme için temel adımlar burada verilmiştir, böylece okuyucular ROS seviyelerini (FITC’nin geometrik araçları) ölçebilecek ve floresan histogramlarını analiz edebileceklerdir. Bu araçlar, sadece hücresel bir hakaretten sonra ROS’taki artışı değerlendirmek için değil, aynı zamanda hücreler üzerinde koruyucu bir etki sağlayabilecek bazı moleküllerin antioksidan etkisini incelemek için de oldukça yararlıdır.
Introduction
Nöral retina, iyi tanımlanmış nöronal tabakalar sunan çok organize bir dokudur. Bunlarda, nöronlar (ganglion, amakrin, bipolar, yatay ve fotoreseptör hücreler) birbirlerine ve ayrıca Müller glial hücrelere (MGC’ler) ve astrositlere bağlanır ve bu da yeterli fototransdüksiyona ve görsel bilginin işlenmesine yol açar 1,2. MGC’lerin retinal homeostazın korunmasında önemli bir role sahip oldukları bilinmektedir, çünkü tüm retinal kesiti geçerler ve böylece çoklu koruyucu süreçleri modüle eden tüm hücre tipleriyle etkileşime girebilirler. MGC’lerin, retinal nöronların bakımı ve hayatta kalması için, nöronlara enerji sağlamak için glikoliz, nöronal atıkların uzaklaştırılması, nörotransmiterlerin geri dönüşümü ve nörotrofik faktörlerin salınması da dahil olmak üzere birçok önemli fonksiyona sahip olduğu bildirilmiştir 3,4,5.
Öte yandan, inflamasyon, oksidatif ve nitrosatif stres, retinopatiler 6,7,8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok insan hastalığının patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynamaktadır. Hücrelerdeki redoks dengesi, ROS seviyelerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesine bağlıdır. ROS, esas olarak aerobik solunumun bir sonucu olarak fizyolojik koşullar altında sürekli olarak üretilir. ROS ailesinin başlıca üyeleri arasında süperoksit anyonu (O 2͘͘͘͘•−), hidroksil radikalleri (•OH), çeşitli peroksitler (ROOR′), hidroperoksitler (ROOH) ve radikal olmayan hidrojen peroksit (H2 O2)12,13 gibi reaktif serbest radikaller bulunur. Son yıllarda, ROS’un temel süreçleri kontrol ederek hücrelerde önemli bir sinyal rolü oynadığı ortaya çıkmıştır. MGC’ler, transkripsiyonel nükleer faktör eritroid-2 ile ilişkili faktör 2’nin (Nrf2) aktivasyonu ve ardından patolojik koşullar altında aşırı ROS üretimini ortadan kaldırmak için antioksidan proteinlerin ekspresyonu ile güçlü bir antioksidan savunmaya sahiptir14,15,16. Hücreler, abartılı bir ROS üretimi veya ROS’u çıkarmak için kusurlu bir yetenek nedeniyle redoks dengesini kaybettiğinde, oksidatif stresin birikmesi, proteinlerde, lipitlerde ve DNA’da zararlı modifikasyonları teşvik ederek hücresel strese veya ölüme yol açar. Retinal antioksidan savunma sisteminin artması, ROP ve RD 17,18,19,20,21,22,23,24 gibi retinopatilerin çözülmesini ve önlenmesini iyileştirir. Bu nedenle, ROS üretiminin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi güçlü ve kullanışlı bir araçtır.
Hücrelerde ROS üretimini veya oksidatif stresi ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar arasında, 2′,7′-diklorofloresein diasetat (DCFH-DA) probu,25,26,27,28 numaralı hücrenin redoks durumunu doğrudan ölçmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu prob lipofilik ve floresan değildir. Bu probun hücre zarı boyunca difüzyonu, iki ester bağındaki hücre içi esterazlar tarafından bölünmesine izin verir ve nispeten polar ve hücre zarı geçirimsiz bir ürün, 2′,7′-diklorofloresein (H2DCF) üretir. Bu floresan olmayan molekül hücre içinde birikir ve daha sonra ROS tarafından oksidasyon, yüksek floresan ürün DCF’yi verir. Probun oksidasyonu, akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi (530 nm’de emisyon ve 485 nm’de uyarım) ile tespit edilebilen çoklu ROS tiplerinin (peroksinitrit, hidroksil radikalleri, nitrik oksit veya peroksitler) etkisinin ürünüdür. Bu tekniğin sınırlaması, süperoksit ve hidrojen peroksitinH2DCF25,29 ile güçlü bir şekilde reaksiyona girmemesidir. Bu yazıda, akış sitometrisi ile ROS’u ölçmek ve ölçmek için DCFH-DA probu kullanıyoruz. Bu nedenle, hücreleri floresan probu ile yüklemeden önce MGC’leri ROS indükleyici, A veya B ile uyararak ROS üretimini indüklüyoruz. Ek olarak, bir antioksidan bileşik kullanıyoruz. Son olarak, bu protokol kullanılarak elde edilen temsili ve güvenilir verileri gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser, inflamatuar hastalıklar, iskemi / reperfüzyon, iskemik kalp hastalığı, diyabet ve retinopatiler gibi çeşitli patolojik durumlar ve ayrıca yaşlanma gibi fizyolojik durumlar ROS aşırı üretimine yol açar 6,7,8,9,10,11. Bu nedenle, ROS’un modülasyonunda yer alan yolun tespiti, ölçülmesi ve anlaşılması…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, CIBICI’den María Pilar Crespo ve Paula Alejandra Abadie’ye (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) akış sitometrisinde yardım için ve Gabriela Furlan ve Noelia Maldonado’ya hücre kültürü yardımı için teşekkür eder. Ayrıca video prodüksiyonu ve düzenlemesi için Victor Diaz’a (FCQ Kurumsal İletişim Yanlısı Sekreteri) teşekkür ederiz.
Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ve Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir.
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
