Summary

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Published: May 13, 2022
doi:

Summary

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC’ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Abstract

Redoks dengesi hücresel homeostazın korunmasında önemli bir role sahiptir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi, proteinlerin, lipitlerin ve DNA’nın modifikasyonunu teşvik eder ve bu da sonunda hücresel fonksiyonda ve hücre ölümünde değişikliğe yol açabilir. Bu nedenle, hücrelerin zararlı hakaretlere yanıt olarak, Keap1 / Nrf2 gibi bir antioksidan yolu aktive ederek veya redoks temizleyicilerini (A, C ve E vitaminleri, β-karoten ve polifenoller, diğerleri arasında) geliştirerek antioksidan savunmalarını arttırmaları faydalıdır. Enflamasyon ve oksidatif stres, diyabetik retinopati (DR) ve prematüre retinopatisi (ROP) gibi retinopatilerin patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynar. Müller glial hücreler (MGC’ler) nöral retina dokusunun homeostazında önemli bir rol oynadığından, bu hücresel koruyucu mekanizmaları incelemek için ideal bir model olarak kabul edilirler. Bu anlamda, ROS seviyelerinin tekrarlanabilir ve basit bir yöntemle ölçülmesi, antioksidan hücre savunma mekanizmasına katılan yolların veya moleküllerin katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu makalede, MGC’lerde DCFH-DA probu ve akış sitometrisi ile ROS ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunuyoruz. yazılım ile akış sitometrisi veri işleme için temel adımlar burada verilmiştir, böylece okuyucular ROS seviyelerini (FITC’nin geometrik araçları) ölçebilecek ve floresan histogramlarını analiz edebileceklerdir. Bu araçlar, sadece hücresel bir hakaretten sonra ROS’taki artışı değerlendirmek için değil, aynı zamanda hücreler üzerinde koruyucu bir etki sağlayabilecek bazı moleküllerin antioksidan etkisini incelemek için de oldukça yararlıdır.

Introduction

Nöral retina, iyi tanımlanmış nöronal tabakalar sunan çok organize bir dokudur. Bunlarda, nöronlar (ganglion, amakrin, bipolar, yatay ve fotoreseptör hücreler) birbirlerine ve ayrıca Müller glial hücrelere (MGC’ler) ve astrositlere bağlanır ve bu da yeterli fototransdüksiyona ve görsel bilginin işlenmesine yol açar 1,2. MGC’lerin retinal homeostazın korunmasında önemli bir role sahip oldukları bilinmektedir, çünkü tüm retinal kesiti geçerler ve böylece çoklu koruyucu süreçleri modüle eden tüm hücre tipleriyle etkileşime girebilirler. MGC’lerin, retinal nöronların bakımı ve hayatta kalması için, nöronlara enerji sağlamak için glikoliz, nöronal atıkların uzaklaştırılması, nörotransmiterlerin geri dönüşümü ve nörotrofik faktörlerin salınması da dahil olmak üzere birçok önemli fonksiyona sahip olduğu bildirilmiştir 3,4,5.

Öte yandan, inflamasyon, oksidatif ve nitrosatif stres, retinopatiler 6,7,8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok insan hastalığının patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynamaktadır. Hücrelerdeki redoks dengesi, ROS seviyelerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesine bağlıdır. ROS, esas olarak aerobik solunumun bir sonucu olarak fizyolojik koşullar altında sürekli olarak üretilir. ROS ailesinin başlıca üyeleri arasında süperoksit anyonu (O 2͘͘͘͘•), hidroksil radikalleri (OH), çeşitli peroksitler (ROOR′), hidroperoksitler (ROOH) ve radikal olmayan hidrojen peroksit (H2 O2)12,13 gibi reaktif serbest radikaller bulunur. Son yıllarda, ROS’un temel süreçleri kontrol ederek hücrelerde önemli bir sinyal rolü oynadığı ortaya çıkmıştır. MGC’ler, transkripsiyonel nükleer faktör eritroid-2 ile ilişkili faktör 2’nin (Nrf2) aktivasyonu ve ardından patolojik koşullar altında aşırı ROS üretimini ortadan kaldırmak için antioksidan proteinlerin ekspresyonu ile güçlü bir antioksidan savunmaya sahiptir14,15,16. Hücreler, abartılı bir ROS üretimi veya ROS’u çıkarmak için kusurlu bir yetenek nedeniyle redoks dengesini kaybettiğinde, oksidatif stresin birikmesi, proteinlerde, lipitlerde ve DNA’da zararlı modifikasyonları teşvik ederek hücresel strese veya ölüme yol açar. Retinal antioksidan savunma sisteminin artması, ROP ve RD 17,18,19,20,21,22,23,24 gibi retinopatilerin çözülmesini ve önlenmesini iyileştirir. Bu nedenle, ROS üretiminin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi güçlü ve kullanışlı bir araçtır.

Hücrelerde ROS üretimini veya oksidatif stresi ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar arasında, 2′,7′-diklorofloresein diasetat (DCFH-DA) probu,25,26,27,28 numaralı hücrenin redoks durumunu doğrudan ölçmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu prob lipofilik ve floresan değildir. Bu probun hücre zarı boyunca difüzyonu, iki ester bağındaki hücre içi esterazlar tarafından bölünmesine izin verir ve nispeten polar ve hücre zarı geçirimsiz bir ürün, 2′,7′-diklorofloresein (H2DCF) üretir. Bu floresan olmayan molekül hücre içinde birikir ve daha sonra ROS tarafından oksidasyon, yüksek floresan ürün DCF’yi verir. Probun oksidasyonu, akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi (530 nm’de emisyon ve 485 nm’de uyarım) ile tespit edilebilen çoklu ROS tiplerinin (peroksinitrit, hidroksil radikalleri, nitrik oksit veya peroksitler) etkisinin ürünüdür. Bu tekniğin sınırlaması, süperoksit ve hidrojen peroksitinH2DCF25,29 ile güçlü bir şekilde reaksiyona girmemesidir. Bu yazıda, akış sitometrisi ile ROS’u ölçmek ve ölçmek için DCFH-DA probu kullanıyoruz. Bu nedenle, hücreleri floresan probu ile yüklemeden önce MGC’leri ROS indükleyici, A veya B ile uyararak ROS üretimini indüklüyoruz. Ek olarak, bir antioksidan bileşik kullanıyoruz. Son olarak, bu protokol kullanılarak elde edilen temsili ve güvenilir verileri gösteriyoruz.

Protocol

NOT: Arabellek bileşimleri için Tablo 1’e bakınız. 1. Hücre kültürü hazırlama NOT: Burada tarif edilen, kendiliğinden ölümsüzleşmiş bir insan Müller glial hücre hattı olan MIO-M1 hücrelerinin kültür hazırlığıdır (Moorfield’s / Institute of Ophthalmology – Müller 1). Her zaman uygun aseptik tekniği kullanın ve laminer bir akış başlığında çalışın. Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle’s …

Representative Results

Protokol bölümünde açıklandığı gibi, ROS indükleyici, A veya B ile uyarılan MIO-M1 hücrelerinden floresan probu DCFH-DA ile ROS üretiminin akış sitometrisi tespitini gösteren temsili ve kantitatif verileri gösterdik. Beklendiği gibi, uyarılmamış hücrelerde otofloresan seviyelerinin üzerindeki FITC floresansında değişiklikler gözlemledik (Şekil 1A, “bazal kontrol” ile “otofloresan kontrolü” karşılaştırması, nokta grafikleri grafiği). Bu, MIO-M1 hücrelerinde …

Discussion

Kanser, inflamatuar hastalıklar, iskemi / reperfüzyon, iskemik kalp hastalığı, diyabet ve retinopatiler gibi çeşitli patolojik durumlar ve ayrıca yaşlanma gibi fizyolojik durumlar ROS aşırı üretimine yol açar 6,7,8,9,10,11. Bu nedenle, ROS’un modülasyonunda yer alan yolun tespiti, ölçülmesi ve anlaşılması…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, CIBICI’den María Pilar Crespo ve Paula Alejandra Abadie’ye (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) akış sitometrisinde yardım için ve Gabriela Furlan ve Noelia Maldonado’ya hücre kültürü yardımı için teşekkür eder. Ayrıca video prodüksiyonu ve düzenlemesi için Victor Diaz’a (FCQ Kurumsal İletişim Yanlısı Sekreteri) teşekkür ederiz.

Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ve Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir.

Materials

2′,7′-DCFH-DA Sigma 35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Gibco by life technologies 15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences FACSCanto
BD FACSDiva software BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100×20 mm Cell Star- Greiner Bio-One 664 160
Centrifuge Thermo Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml) BIOFIL CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml) BIOFIL CFT011500
Cryovial CRYO.S – Greiner Bio-One 126263
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate Merck 106575
DMEM without phenol red Gibco by life technologies 31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco by life technologies 11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate Merck 324503
Fetal Bovine Serum Internegocios
FlowJo v10 Software BD Biosciences
Glucose Merck 108337
hemocytometer, Neubauer chamber BOECO,Germany
Laminar flow hood ESCO AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX) Gibco by life technologies A12860-01
MitoSOX Red Invitrogen  M36008
Penicillin/Streptomycin Gibco by life technologies 15140-122
Potassium Chloride Merck 104936
Potassium-dihydrogen phosphate Merck 4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) Falcon – Corning BD-352008
Sodium Azide Merck 822335
Sodium Chloride Merck 106404
Sodium Hydroxide Merck 106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml Tarson 500010-N
Tissue Culture Plate 6 well BIOFIL TCP011006
Trypan Blue Merck 111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X Gibco by life technologies 15400-054
Vortex Mixer Labnet International, Inc.

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

Play Video

Cite This Article
Vaglienti, M. V., Subirada, P. V., Barcelona, P. F., Bonacci, G., Sanchez, M. C. Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in Müller Glial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63337, doi:10.3791/63337 (2022).

View Video