Summary

Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes

Published: February 09, 2022
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Summary

Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.

Abstract

Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales 1,2. Ces obstacles ont produit une grande demande d’avoir un protocole pour générer des CSM in vitro. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) peuvent être utilisées comme source précieuse de CSM, présentant les caractéristiquesdes CSM 3,4,5. Les CSM dérivées des CSPi peuvent être utilisées comme option thérapeutique dans plusieurs maladies. En outre, la capacité des CSM dérivées des CSPi à générer des adipocytes en fait un modèle humain in vitro précieux pour étudier l’adipogenèse humaine, l’obésité et les troubles associés aux adipocytes.

Les protocoles actuels de différenciation des adipocytes peuvent être classés en deux groupes, l’un impliquant la différenciation des adipocytes à l’aide de cocktails chimiques ou à base de protéines donnant un rendement résultant de 30%-60%6,7,8,9, tandis que l’autre impliquant une manipulation génétique pour une induction robuste de facteurs de transcription clés régissant le développement des adipocytes pour donner un rendement de 80%-90%10, 11. Cependant, la manipulation génétique ne récapitule pas le processus naturel de différenciation des adipocytes et masque souvent les paradigmes subtils arrivant au cours de l’adipogenèse, ce qui la rend inefficace à des fins de modélisation de la maladie12,13. Par conséquent, nous présentons un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement des adipocytes immatures en marquant par fluorescence les adipocytes lipidiques à l’aide de rouge du Nil.

Nous présentons ici un protocole impliquant l’incubation transitoire de corps embryoïdes (EB) dérivés de CSPi avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour produire un grand nombre de CSM à prolifération rapide, qui pourraient être utilisés pour générer des adipocytes14. Nous présentons également un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement du pool de différenciation hétérogène en marquant par fluorescence leurs gouttelettes lipidiques à l’aide d’un colorant lipophile; Nil rouge. Cela permettrait la génération d’une population pure d’adipocytes matures avec une fonctionnalité améliorée pour modéliser avec précision les troubles métaboliques associés aux adipocytes.

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du HMC (n° 16260/16) et de l’ICRQ (n° 2016-003). Ce travail est également optimisé pour les CSEh tels que H1 et H9. Des échantillons de sang ont été prélevés sur d…

Representative Results

Schéma et morphologie des cellules au cours de la différenciation mésenchymateuse : La différenciation des CSPi en CSM implique différents stades de développement allant de la formation de l’EB, de la différenciation des CSM et de l’expansion des CSM (Figure 1). Au cours de ces stades de développement, les cellules acquièrent une morphologie variée en raison des différents produits chimiques stimulants auxquels elles sont soumises. Lors du début de la différenciation, les ce…

Discussion

Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois14,15, ce protocole étant applicable ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (subvention n° NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi a bénéficié d’une bourse GSRA du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF).

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975
MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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Cite This Article
Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

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