Протокол позволяет генерировать чистую популяцию адипоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Ретиноевая кислота используется для дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые используются для производства адипоцитов. Затем для получения чистых адипоцитов используется подход сортировки, основанный на окрашивании Нила в красный цвет.
Последние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволили генерировать различные типы клеток, включая адипоциты. Однако современные методы дифференцировки имеют низкую эффективность и не дают однородной популяции адипоцитов. Здесь мы обходим эту проблему, используя полностью транс-ретиноевый метод для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с высоким выходом. Регулируя пути, регулирующие пролиферацию, выживание и адгезию клеток, наша стратегия дифференцировки позволяет эффективно генерировать эмбриональные тела (БЭ), которые дифференцируются в чистую популяцию мультипотентных МСК. Большое количество МСК, генерируемых этим методом, является идеальным источником для генерации адипоцитов. Однако гетерогенность образца в результате дифференцировки адипоцитов остается проблемой. Поэтому мы использовали метод очистки липидсодержащих зрелых адипоцитов на основе нильского краса с помощью FACS. Эта стратегия сортировки позволила нам установить надежный способ моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами, с использованием пула адипоцитов с уменьшенной гетерогенностью образца и улучшенной функциональностью клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) действуют как эффективный транзиторный ресурс для производства клеток мезодермального происхождения, таких как адипоциты, остеоциты и хондроциты, которые в дальнейшем могут быть использованы для моделирования соответствующих генетических нарушений. Однако предыдущие подходы основывались на получении этих МСК из тканей взрослого человека 1, что создавало проблему получения их в больших количествах от доноров и ограничение их функциональной жизнеспособности в неоптимальных условиях культивирования in vitro 1,2. Эти препятствия породили большой спрос на протокол для генерации МСК in vitro. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) могут быть использованы в качестве ценного источника МСК, проявляя характеристикиМСК 3,4,5. МСК, полученные из ИПСК, могут использоваться в качестве терапевтического варианта при нескольких заболеваниях. Кроме того, способность МСК, полученных из ИПСК, генерировать адипоциты, делает их ценной моделью человека in vitro для изучения адипогенеза человека, ожирения и заболеваний, связанных с адипоцитами.
Современные протоколы дифференцировки адипоцитов можно разделить на две группы, одна из которых включает дифференцировку адипоцитов с использованием химических или белковых коктейлей, дающих результирующий выход 30%-60%6,7,8,9, а другая включает генетические манипуляции для надежной индукции ключевых факторов транскрипции, регулирующих развитие адипоцитов, чтобы дать выход 80%-90%10, 11. Однако генетические манипуляции не повторяют естественный процесс дифференцировки адипоцитов и часто маскируют тонкие парадигмы, возникающие во время адипогенеза, что делает его неэффективным для целей моделирования заболеваний12,13. Таким образом, мы представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов от незрелых путем флуоресцентной маркировки липидсодержащих адипоцитов с использованием нильского красного.
Здесь мы представляем протокол, включающий транзиторную инкубацию эмбриоидных тел (БЭ), полученных из ИПСК, с полностью транс-ретиноевой кислотой для получения большого количества быстро пролиферирующих МСК, которые в дальнейшем могут быть использованы для получения адипоцитов14. Мы также представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов из пула гетерогенной дифференцировки путем флуоресцентной маркировки их липидных капель с использованием липофильного красителя; Нил красный. Это позволило бы создать чистую популяцию зрелых адипоцитов с расширенной функциональностью для точного моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами.
Этот протокол имеет первостепенное значение из-за его способности обеспечивать высокую производительность и эффективность МСК. Это массовое производство МСК стало возможным благодаря переходной инкубации ЭБ, полученных из ИПСК, с 10 мкМ RA14,15. Транзиторн…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No NPRP10-1221-160041). Марьям Агади получила стипендию GSRA от Катарского национального исследовательского фонда (QNRF).
Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |