Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti
Summary
Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L’acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.
Abstract
I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso la generazione di diversi tipi di cellule, compresi gli adipociti. Tuttavia, gli attuali metodi di differenziazione hanno una bassa efficienza e non producono una popolazione omogenea di adipociti. Qui, eludiamo questo problema utilizzando un metodo basato sul retinoico completamente trans per produrre cellule staminali mesenchimali (MSC) ad alto rendimento. Regolando i percorsi che regolano la proliferazione, la sopravvivenza e l’adesione cellulare, la nostra strategia di differenziazione consente la generazione efficiente di corpi embrionali (EB) che si differenziano in una popolazione pura di MSC multipotenti. L’elevato numero di MSC generate da questo metodo fornisce una fonte ideale per la generazione di adipociti. Tuttavia, l’eterogeneità del campione derivante dalla differenziazione degli adipociti rimane una sfida. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo a base di rosso del Nilo per purificare gli adipociti maturi portatori di lipidi utilizzando FACS. Questa strategia di selezione ci ha permesso di stabilire un modo affidabile per modellare i disordini metabolici associati agli adipociti utilizzando un pool di adipociti con ridotta eterogeneità del campione e funzionalità cellulare migliorata.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) agiscono come un’efficace risorsa transitoria per la produzione di cellule di origine mesodermica come adipociti, osteociti e condrociti, che potrebbero essere ulteriormente utilizzate per modellare le rispettive malattie genetiche. Tuttavia, gli approcci precedenti si basavano sul raggiungimento di queste MSC da tessuti adulti 1, il che imponeva la sfida di ottenerle in numero elevato dai donatori e la limitazione di mantenerle funzionalmente vitali in condizioni di coltura in vitro non ottimali 1,2. Questi ostacoli hanno prodotto una grande richiesta di avere un protocollo per la generazione di MSC in vitro. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) possono essere utilizzate come preziosa fonte di MSC, presentando caratteristiche MSC 3,4,5. Le MSC derivate da iPSCs possono essere utilizzate come opzione terapeutica in diverse malattie. Inoltre, la capacità delle MSC derivate da iPSC di generare adipociti, le rende un prezioso modello umano in vitro per studiare l’adipogenesi umana, l’obesità e i disturbi associati agli adipociti.
Gli attuali protocolli di differenziazione degli adipociti possono essere classificati in due gruppi, uno dei quali coinvolge la differenziazione degli adipociti utilizzando cocktail chimici o a base proteica che danno una resa risultante del 30% -60% 6,7,8,9, mentre l’altro che coinvolge la manipolazione genetica per una robusta induzione dei fattori chiave di trascrizione che governano lo sviluppo degli adipociti per ottenere una resa dell’80% -90% 10, 11. Tuttavia, la manipolazione genetica non ricapitola il naturale processo di differenziazione degli adipociti e spesso maschera i sottili paradigmi che arrivano durante l’adipogenesi, rendendola inefficace ai fini della modellizzazione della malattia12,13. Pertanto, presentiamo un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica da quelli immaturi etichettando in modo fluorescente gli adipociti portatori di lipidi usando il rosso del Nilo.
Qui presentiamo un protocollo che prevede l’incubazione transitoria di corpi embrioidi derivati da iPSCs (EB) con acido retinoico all-trans per produrre un elevato numero di MSC in rapida proliferazione, che potrebbero essere ulteriormente utilizzati per generare adipociti14. Presentiamo anche un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica dal pool di differenziazione eterogenea etichettando fluorescentmente le loro goccioline lipidiche usando un colorante lipofilo; Rosso Nilo. Ciò consentirebbe la generazione di una popolazione pura di adipociti maturi con funzionalità migliorata per modellare accuratamente i disturbi metabolici associati agli adipociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo riveste un’importanza fondamentale grazie alla sua capacità di fornire MSC in termini di rendimento ed efficienza elevati. Questa produzione su larga scala di MSC è stata resa possibile dall’incubazione transitoria di EB derivate da iPSCs con 10 μM di RA14,15. Il trattamento transitorio con 10 μM di RA ha aumentato la resa MSC da 11,2 a 1542 volte14,15, con questo protocollo applicab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi è stata sostenuta dalla borsa di studio GSRA del Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
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