Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas

A arquitetura de microtúbulos varia amplamente entre diferentes tipos de células para suportar diversas funções ^1,2. Sua natureza dinâmica de crescimento e encolhimento permite uma rápida adaptação a pistas extra e intracelulares e responder às necessidades em constante mudança de uma célula. Assim, pode ser considerada como a “impressão digital morfológica” desempenhando um papel fundamental na identidade celular.

O direcionamento farmacológico do citoesqueleto microtúbulo usando inibidores de pequenas moléculas levou a uma infinidade de descobertas fundamentais na biologia do desenvolvimento, biologia de células-tronco, biologia do câncer e neurobiologia 3,4,5,6,7. Essa abordagem, embora indispensável, apresenta várias limitações, como toxicidade e efeitos fora do alvo. Por exemplo, um dos agentes de microtúbula mais utilizados, nocodazole, é uma poderosa droga despolimerizadora de microtúbulos⁸. No entanto, inibidores de pequenas moléculas como o nocodazol são ativos desde o momento da aplicação e, dada a natureza essencial do citoesqueleto microtúbulo para muitas funções celulares críticas, a despolimerização global de microtúbulos pode produzir efeitos fora do alvo, que podem ser inadequados para muitas aplicações. Além disso, o tratamento do nocodazol é irreversível, a menos que as amostras sejam lavadas livre da droga, prevenindo imagens vivas contínuas e, portanto, o rastreamento preciso de filamentos microtúbulos individuais.

O desenvolvimento de compostos ativados pela luz começou com a criação de moléculas fotouncaged e anunciou uma nova era na segmentação e monitoramento dos efeitos da inibição do crescimento de microtúbulos de forma precisa e espacialmente controlada. Uma família de drogas reversivelmente fotowitchable, fotostatinas (PSTs), foram desenvolvidas substituindo o componente de stilbene da combretastatina A-4 por azobenzeno⁹. Os PSTs estão inativos até a iluminação com luz UV, pela qual a configuração trans inativa se converte na configuração cis ativa por isomerização reversível. Os Cis-PSTs inibem a polimerização de microtúbulos ligando-se ao local de ligação colchicina de β-tubulina, bloqueando sua interface com β-tubulina e prevenindo a dimerização necessária para o crescimento de microtúbulos¹⁰. Entre uma coorte de PSTs, pst-1P emergiu como um composto de chumbo, pois tem a maior potência, é totalmente solúvel em água, e mostra um rápido início de bioatividade após a iluminação.

A trans-isomerização mais eficaz de PSTs ocorre em comprimentos de onda entre 360-420 nm, o que permite duas opções para ativação de PST. Uma linha laser de 405 nm em um microscópio confocal típico pode ser administrada para o direcionamento espacial ideal da inibição do crescimento de microtúbulos. A capacidade de identificar a localização e o tempo da ativação do PST através da iluminação laser de 405 nm facilita o controle temporal e espacial preciso, permitindo a interrupção da dinâmica dos microtúbulos em um nível subcelular, dentro do vezes de resposta sub-segundo⁹. Alternativamente, uma luz LED UV acessível permite que a iluminação do organismo inteiro induza a interrupção em todo o organismo da arquitetura do microtúbulo. Esta pode ser uma alternativa econômica para pesquisadores para os quais o início precisamente cronometrado da inibição, em vez de direcionamento espacial, é o objetivo. Outra característica dos PSTs é sua inativação sob demanda, aplicando luz verde de um comprimento de onda na faixa de 510-540 nm⁹. Isso permite o rastreamento de filamentos microtúbulos antes, durante e depois da inibição de crescimento mediada pelo PST.

Os PSTs, embora ainda um projeto relativamente recente, têm sido usados em inúmeras aplicações in vitro em diversos campos de pesquisa¹¹, incluindo a investigação de novos mecanismos de migração celular em ameebóides¹², em neurônios isolados do cérebro do camundongo recém-nascido¹³, e desenvolvimento de epitélio de asa em Drosophila melanogaster¹⁴ . Outras drogas leves reativas provaram ser ferramentas valiosas na interrupção direcionada da função celular. Por exemplo, um análogo de blebbistatina, azidoblebbistatin, foi usado para a inibição aprimorada da mosina sob iluminação^15,16. Isso destaca o potencial para novas descobertas devido à capacidade de inibição espacialmente controlada da função celular.

Organismos 3D vivos apresentam sistemas soberbos e ainda mais delicados para manipular a dinâmica dos microtúbulos em um nível animal inteiro, unicelular ou subcelular em condições fisiológicas. Em particular, o embrião do rato de pré-implantação oferece uma visão excepcional do funcionamento interno da célula, bem como das relações intercelulares dentro de um organismo¹⁷. Ciclos consecutivos de ativação e desativação de PSTs contribuíram para a caracterização da ponte interfase, uma estrutura pós-citocinética entre as células, como um centro-organizador de microtúbulos não centrosômicos no embrião de camundongos pré-implantação¹⁶. Uma configuração experimental semelhante demonstrou o envolvimento de microtúbulos crescentes na vedação do embrião do rato para permitir a formação de blastocisto¹⁸. Além disso, os PSTs também foram usados em embriões inteiros de zebrafish para investigar a migração de células neuronais inibindo o crescimento de microtúbulos em um subconjunto de células no cérebro traseiro¹⁹.

Este protocolo descreve a configuração experimental e o uso de PST-1P no embrião do rato de pré-implantação. As instruções aqui apresentadas também podem orientar a aplicação de PSTs para uma ampla gama de objetivos, como o estudo da segregação de cromossomo e divisão celular, tráfico de carga intracelular e morfogênese celular e migração. Além disso, tais estudos auxiliarão a implementação de PSTs em sistemas organoides, blastóides e outros modelos de embriões, como Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, bem como potencialmente expandirão o uso de PSTs para tecnologias de fertilização in vitro .