フォトスタチンを用いた生きた着床前マウス胚における微小管細胞骨格の時空間的細胞内操作

微小管アーキテクチャは、多様な機能をサポートするために、異なる細胞タイプ間で大きく異なる^1,2。成長と収縮のそのダイナミックな性質は、細胞外および細胞内の手がかりへの迅速な適応を可能にし、細胞の絶え間なく変化するニーズに応えることを可能にする。したがって、それは細胞の同一性において重要な役割を果たす「形態学的指紋」と考えることができる。

小分子阻害剤を用いた微小管細胞骨格の薬理学的標的化は、発生生物学、幹細胞生物学、癌生物学、および神経生物学³、⁴、⁵、⁶、⁷における多数の基本的な発見をもたらしている。このアプローチは、不可欠ではありますが、毒性やオフターゲット効果など、さまざまな限界があります。例えば、最も広く使用されている微小管標的化剤の1つであるノコダゾールは、強力な微小管脱重合剤⁸である。しかしながら、ノコダゾールのような小分子阻害剤は、適用時から活性であり、微小管細胞骨格が多くの重要な細胞機能に必須の性質を有することを考えると、微小管のグローバルな解重合はオフターゲット効果を生じる可能性があり、これは多くの用途には適さない可能性がある。さらに、ノコダゾール処理は、サンプルを薬物なしで洗浄しない限り不可逆的であり、連続的なライブイメージング、したがって個々の微小管フィラメントの正確な追跡を妨げる。

光活性化化合物の開発は、光アンケージド分子の創製から始まり、微小管成長阻害の影響を正確かつ時空間的に制御された方法で標的化およびモニタリングする新しい時代を告げた。可逆的に光交換可能な薬物の1つのファミリーであるフォトスタチン(PST)は、コンブレタスタチンA-4のスチルベン成分をアゾベンゼン⁹で置き換えることによって開発された。PSTはUV光による照明まで不活性であり、それによって不活性 トランス配置は可逆的異性化によって活性 シス配置に変換される。 Cis-PSTsは、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、β-チューブリンとの界面を遮断し、微小管増殖に必要な二量体化を防止することによって微小管重合を阻害する¹⁰。PSTのコホートの中で、PST-1Pは、最も高い効力を有し、完全に水溶性であり、照明後に生理活性の急速な発症を示すため、鉛化合物として浮上している。

PSTの最も効果的な トランスから シス異性化は、360〜420nmの波長で起こり、PST活性化のための二重オプションを可能にする。典型的な共焦点顕微鏡上の405nmレーザーラインを投与して、微小管成長阻害の最適な空間ターゲティングを行うことができる。405nmレーザー照射によるPST活性化の位置とタイミングを正確に特定する機能は、正確な時間的および空間的制御を容易にし、1秒未満の応答時間内に細胞内レベルで微小管ダイナミクスの破壊を可能にします⁹。あるいは、手頃な価格のLED UV光は、生物全体の照明が微小管アーキテクチャの生物全体の破壊を誘発することを可能にする。これは、空間的ターゲティングではなく、正確にタイミングを合わせた阻害の開始が目標である研究者にとって、費用対効果の高い代替手段となる可能性があります。PSTのもう1つの特徴は、510〜540nmの範囲の波長の緑色光を印加することによってオンデマンドで不活性化^{されることです9}。これにより、PST媒介性増殖阻害の前、最中、および後の微小管フィラメントのトレースが可能になります。

PSTsは、まだ比較的最近の設計ではあるが、アメーバイド¹²、新生児マウス13の脳から単離されたニューロンにおける細胞遊走の新しいメカニズムの調査、ショウジョウバエメラノガ^スター14における翼上皮の発生の調査を含む、多様な研究分野^にわたる多数のin vitroアプリケーション¹¹で使用されてきた。.他の光反応性薬物は、細胞機能の標的破壊において貴重なツールであることが証明されている。例えば、ブレビスタチンの類似体であるアジドブレビスタチンを、照明下でのミオシン阻害の増強に使用した^15、16。これは、細胞機能の時空間的に制御された阻害の能力による新しい発見の可能性を強調している。

生きた3D生物は、生理学的条件下で動物全体、単一細胞、または細胞内レベルで微小管のダイナミクスを操作するための、優れた、より繊細なシステムを提示します。特に、着床前マウス胚は、細胞の内部の働きならびに生物内の細胞間関係についての例外的な洞察を提供する¹⁷。PSTの活性化および不活性化の時間的および空間的に標的化された連続的なサイクルは、着床前マウス胚¹⁶における非中心染色体微小管組織化中心としての、細胞間の細胞間運動学的構造である相間架橋の特性評価に寄与した。同様の実験セットアップは、胚盤胞形成を可能にするためにマウス胚のシーリングにおける微小管の成長の関与を実証し^た18。さらに、PSTsは、後脳内の細胞のサブセットにおける微小管増殖を阻害することによって神経細胞遊走を調べるために、ゼブラフィッシュ胚全体においても使用された¹⁹。

このプロトコルは、着床前マウス胚におけるPST-1Pの実験セットアップおよび使用を記載する。ここで提示された指示はまた、染色体の分離および細胞分裂の研究、細胞内貨物の輸送、ならびに細胞の形態形成および遊走の研究など、幅広い目的のためのPSTの適用を導くことができる。さらに、このような研究は、オルガノイド系、芽球状、および Caenorhabditis elegans および Xenopus laevisなどの他の胚モデルにおけるPSTの実装を支援し、 体外 受精技術のためのPSTの使用を拡大する可能性がある。