Manipolazione subcellulare spaziotemporale del citoscheletro del microtubulo nell'embrione di topo vivente preimpianto utilizzando le fotostattine

L’architettura dei microtubuli varia ampiamente tra i diversi tipi di cellule per supportare diverse funzioni ^1,2. La sua natura dinamica di crescita e restringimento consente un rapido adattamento a segnali extra- e intracellulari e di rispondere alle esigenze in continua evoluzione di una cellula. Quindi, può essere considerato come la “impronta digitale morfologica” che svolge un ruolo chiave nell’identità cellulare.

Il targeting farmacologico del citoscheletro dei microtubuli utilizzando inibitori di piccole molecole ha portato a una pletora di scoperte fondamentali nella biologia dello sviluppo, nella biologia delle cellule staminali, nella biologia del cancro e nella neurobiologia 3,4,5,6,7. Questo approccio, sebbene indispensabile, presenta varie limitazioni come la tossicità e gli effetti fuori bersaglio. Ad esempio, uno degli agenti bersaglio dei microtubuli più utilizzati, il nocodazolo, è un potente farmaco depolimerizzante dei microtubuli⁸. Tuttavia, gli inibitori di piccole molecole come il nocodazolo sono attivi dal momento dell’applicazione e, data la natura essenziale del citoscheletro dei microtubuli a molte funzioni cellulari critiche, la depolimerizzazione globale dei microtubuli può produrre effetti fuori bersaglio, che possono essere inadatti per molte applicazioni. Inoltre, il trattamento con nocodazolo è irreversibile a meno che i campioni non vengano lavati senza il farmaco, impedendo l’imaging vivo continuo e, quindi, il tracciamento preciso dei singoli filamenti di microtubuli.

Lo sviluppo di composti attivati dalla luce è iniziato con la creazione di molecole fotonunciate e ha annunciato una nuova era nel targeting e nel monitoraggio degli effetti dell’inibizione della crescita dei microtubuli in modo preciso e controllato spaziotemporalmente. Una famiglia di farmaci reversibilmente fotocommutabili, le fotostattine (PST), sono state sviluppate sostituendo il componente stilbene della combretastatina A-4 con l’azobenzene⁹. I PST sono inattivi fino all’illuminazione con luce UV, per cui la trans-configurazione inattiva si converte nella configurazione cis attiva mediante isomerizzazione reversibile. I Cis-PST inibiscono la polimerizzazione dei microtubuli legandosi al sito di legame della colchicina della β-tubulina, bloccando la sua interfaccia con β-tubulina e impedendo la dimerizzazione necessaria per la crescita dei microtubuli¹⁰. Tra una coorte di PST, PST-1P è emerso come un composto di piombo in quanto ha la più alta potenza, è completamente solubile in acqua e mostra un rapido inizio di bioattività dopo l’illuminazione.

L’isomerizzazione trans-cis più efficace dei PST si verifica a lunghezze d’onda comprese tra 360-420 nm, il che consente la doppia opzione per l’attivazione PST. Una linea laser da 405 nm su un tipico microscopio confocale può essere somministrata per un targeting spaziale ottimale dell’inibizione della crescita dei microtubuli. La capacità di individuare la posizione e la tempistica dell’attivazione PST attraverso l’illuminazione laser a 405 nm facilita un controllo temporale e spaziale preciso, consentendo l’interruzione della dinamica dei microtubuli a livello subcellulare, entro tempi di risposta inferiori al secondo⁹. In alternativa, una luce UV a LED a prezzi accessibili consente all’illuminazione dell’intero organismo di indurre l’interruzione dell’architettura dei microtubuli a livello di organismo. Questa può essere un’alternativa economica per i ricercatori per i quali l’inizio preciso dell’inibizione, piuttosto che il targeting spaziale, è l’obiettivo. Un’altra caratteristica dei PST è la loro inattivazione su richiesta applicando la luce verde di una lunghezza d’onda nell’intervallo 510-540 nm⁹. Ciò consente di tracciare i filamenti di microtubuli prima, durante e dopo l’inibizione della crescita mediata da PST.

I PST, pur essendo ancora un progetto relativamente recente, sono stati utilizzati in numerose applicazioni in vitro in diversi campi di ricerca¹¹, tra cui lo studio di nuovi meccanismi di migrazione cellulare negli ameboidi¹², nei neuroni isolati dal cervello del topo neonato¹³ e lo sviluppo dell’epitelio alare in Drosophila melanogaster¹⁴ . Altri farmaci reattivi alla luce hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per l’interruzione mirata della funzione cellulare. Ad esempio, un analogo di blebbistatin, azidoblebbistatin, è stato utilizzato per una maggiore inibizione della miosina sotto illuminazione^15,16. Ciò evidenzia il potenziale per nuove scoperte grazie alla capacità di inibizione della funzione cellulare controllata spatiotemporalmente.

Gli organismi 3D vivi presentano sistemi superbi ma più delicati per manipolare la dinamica dei microtubuli a livello di intero animale, singola cellula o subcellulare in condizioni fisiologiche. In particolare, l’embrione di topo preimpianto offre una visione eccezionale del funzionamento interno della cellula e delle relazioni intercellulari all’interno di un organismo¹⁷. Cicli consecutivi di attivazione e disattivazione dei PST temporalmente e spazialmente mirati hanno contribuito alla caratterizzazione del ponte interfase, una struttura post-citocinetica tra cellule, come centro di organizzazione dei microtubuli non centrosomiali nell’embrione di topo preimpianto¹⁶. Una configurazione sperimentale simile ha dimostrato il coinvolgimento dei microtubuli in crescita nella sigillatura dell’embrione di topo per consentire la formazione di blastocisti¹⁸. Inoltre, i PST sono stati utilizzati anche in embrioni interi di zebrafish per studiare la migrazione delle cellule neuronali inibendo la crescita di microtubuli in un sottogruppo di cellule nel cervello posteriore¹⁹.

Questo protocollo descrive la configurazione sperimentale e l’uso di PST-1P nell’embrione di topo preimpianto. Le istruzioni qui presentate possono anche guidare l’applicazione dei PST per una vasta gamma di obiettivi come lo studio della segregazione cromosomica e della divisione cellulare, il traffico di carichi intracellulari e la morfogenesi e migrazione cellulare. Inoltre, tali studi aiuteranno l’implementazione di PST in sistemi organoidi, blastoidi e altri modelli embrionali come Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, oltre a espandere potenzialmente l’uso di PST per le tecnologie di fecondazione in vitro .