מניפולציה תת-תאית של מיקרוטובול ציטוספקלטון בעובר עכבר קדם-ההשתלה החי באמצעות פוטוסטטינים

ארכיטקטורת המיקרוטובולה משתנה באופן נרחב בין סוגי תאים שונים כדי לתמוך בפונקציות מגוונות ^1,2. האופי הדינמי של צמיחה והתכווצות מאפשר הסתגלות מהירה לרמזים חוץ-תאיים ותאיים ולהגיב לצרכים המשתנים ללא הרף של תא. לפיכך, זה יכול להיחשב “טביעת אצבע מורפולוגית” משחק תפקיד מפתח בזהות התאית.

מיקוד פרמקולוגי של ציטוספקלטון microtubule באמצעות מעכבי מולקולות קטנות הוביל שפע של תגליות בסיסיות בביולוגיה התפתחותית, ביולוגיה של תאי גזע, ביולוגיה של סרטן, נוירוביולוגיה ^3,4,5,6,7. גישה זו, למרות שהיא הכרחית, מציגה מגבלות שונות כגון רעילות ואפקטים מחוץ למטרה. לדוגמה, אחד הסוכנים הנפוצים ביותר למיקוד מיקרוטובול, נוקודזול, הוא תרופה רבת עוצמה למיקרוטובולה-depolymerizing⁸. עם זאת, מעכבי מולקולות קטנות כגון nocodazole פעילים מרגע היישום, ובהתחשב באופי החיוני של ציטוסקלטון microtubule לפונקציות תאיות קריטיות רבות, depolymerization גלובלי של microtubules יכול לייצר השפעות מחוץ למטרה, אשר עשוי להיות לא מתאים עבור יישומים רבים. בנוסף, טיפול נוקודזול הוא בלתי הפיך אלא אם כן דגימות נשטפות ללא התרופה, מניעת הדמיה חיה מתמשכת, ובכך, מעקב מדויק של חוטי microtubule בודדים.

הפיתוח של תרכובות המופעלות באור החל עם יצירת מולקולות photouncaged ובישר עידן חדש מיקוד וניטור ההשפעות של עיכוב צמיחה microtubule באופן מדויק ו spatiotemporally נשלט. משפחה אחת של תרופות הניתנות לצילום הפיך, פוטוסטטינים (PSTs), פותחו על ידי החלפת רכיב הסטילבן של קומברטסטטין A-4 עם אזובנזן⁹. PSTs אינם פעילים עד הארה עם אור UV, לפיו טרנס-תצורה לא פעילה מומרת לתצורת cis פעילה על ידי איזומריזציה הפיכה. Cis-PSTs לעכב פילמור microtubule על ידי קשירה לאתר כריכת קולכיצין של β-tubulin, חסימת הממשק שלה עם β-טובולין ומניעת עמעום הנדרש לצמיחת microtubule¹⁰. בין קבוצה של PSTs, PST-1P הופיע כתרכובת עופרת כפי שיש לו את העוצמה הגבוהה ביותר, הוא מסיס במים לחלוטין, ומראה התחלה מהירה של ביואקטיביות לאחר תאורה.

הטרנס-לסיס-איזומריזציה היעילה ביותר של PSTs מתרחשת באורכי גל בין 360-420 ננומטר, המאפשרת אפשרויות כפולות להפעלת PST. קו לייזר 405 ננומטר על מיקרוסקופ קונפוקלי טיפוסי יכול להינתן עבור מיקוד מרחבי אופטימלי של עיכוב צמיחה microtubule. היכולת לאתר במדויק את המיקום והתזמון של הפעלת PST באמצעות תאורת לייזר 405 ננומטר מאפשרת שליטה זמנית ומרחבית מדויקת, ומאפשרת שיבוש של דינמיקת microtubule ברמה תת-תאית, בתוך תגובה תת-שנייה כפול⁹. לחלופין, אור UV LED במחיר סביר מאפשר תאורת אורגניזם שלם כדי לגרום להפרעה כלל אורגניזם של ארכיטקטורת microtubule. זו עשויה להיות חלופה חסכונית עבור חוקרים שעבורם תחילת העיכוב המתוזמנת במדויק, ולא פילוח מרחבי, היא המטרה. תכונה נוספת של PSTs היא ההשבתה לפי דרישה שלהם על ידי החלת אור ירוק של אורך גל בטווח 510-540 ננומטר⁹. זה מאפשר מעקב של חוטי microtubule לפני, במהלך, ואחרי עיכוב צמיחה בתיווך PST.

PSTs, בעוד עדיין עיצוב עדכני יחסית, שימשו ביישומי הפריה חוץ גופית רבים על פני תחומי מחקר מגוונים¹¹, כולל חקירת מנגנונים חדשים של נדידת תאים באמביואידים¹², בנוירונים מבודדים ממוחו של העכבר שזה עתה נולד¹³, ופיתוח אפיתל כנף ב Drosophila מלנוגאסטר¹⁴ . תרופות אחרות תגובת אור הוכיחו להיות כלים בעלי ערך בשיבוש ממוקד של תפקוד הסלולר. לדוגמה, אנלוגי של blebbistatin, אזידובלביסטין, שימש לעיכוב מיוזין משופר תחת תאורה^15,16. זה מדגיש את הפוטנציאל לתגליות חדשות בשל היכולת לעיכוב מבוקר spatiotemporally של תפקוד הסלולר.

אורגניזמים תלת-ממדיים חיים מציגים מערכות מעולות אך עדינות יותר לתפעל דינמיקה של מיקרוטובול ברמה של חיה שלמה, חד-תאית או תת-תאית בתנאים פיזיולוגיים. בפרט, עובר העכבר טרום ההשתלה מציע תובנה יוצאת דופן על הפעולות הפנימיות של התא, כמו גם יחסים בין תאיים בתוך אורגניזם¹⁷. מחזורים רצופים ממוקדים זמנית ומרחבית של הפעלה ונטרול של PSTs תרמו לאפיון הגשר הבין-פאזי, מבנה פוסט-ציטוקינטי בין תאים, כמרכז לארגון מיקרוטובולה לא-קנטרוסומלית בעובר העכבר טרום ההשתלה¹⁶. התקנה ניסיונית דומה הדגימה את המעורבות של גידול מיקרוטובולות באיטום עובר העכבר כדי לאפשר היווצרות בלסטוציסט¹⁸. יתר על כן, PSTs שימשו גם בעוברים של דגי זברה שלמים כדי לחקור נדידת תאים עצביים על ידי עיכוב צמיחת microtubule בקבוצת משנה של תאים ב hindbrain¹⁹.

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה הניסיונית ואת השימוש של PST-1P בעובר עכבר טרום ההשתלה. ההוראות המוצגות כאן יכולות גם להנחות את היישום של PSTs למגוון רחב של מטרות כגון לימוד הפרדת כרומוזום וחלוקת תאים, סחר במטען תאי ומורפוגנזה של תאים והגירה. יתר על כן, מחקרים כאלה יסייעו ליישום של PSTs במערכות organoid, blastoids, ומודלים עוברים אחרים כגון Elegans Caenorhabditis ו Xenopus laevis, כמו גם פוטנציאל להרחיב את השימוש PSTs לטכנולוגיות הפריה חוץ גופית.