مناهج رسم الخرائط الكيميائية لدراسة عدوى المثقبيات
Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد لتوزيع الأيض أثناء عدوى المثقبيات ، بما في ذلك جمع العينات ، واستخراج الأيض ، ونظرة عامة على اكتساب بيانات قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل ، وتوليد نموذج 3D ، وأخيرا ، تصور البيانات.
Abstract
تشير المدارية المسببة للأمراض والاستوائية المرضية إلى مواقع الأنسجة المستعمرة أو المتضررة بشكل انتقائي من مسببات الأمراض ، مما يؤدي إلى أعراض المرض الموضعية. تشمل طفيليات المثقبيات البشرية المعدية المثقبيات Trypanosoma cruzi ، العامل المسبب لمرض شاغاس. المثقبيات بروسي ، العامل المسبب لمرض النوم ؛ وأنواع الليشمانيا ، العوامل المسببة لداء الليشمانيات . وهي تؤثر مجتمعة على 20 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. تظهر هذه الطفيليات استوائية محددة: القلب والمريء والقولون ل T. cruzi والأنسجة الدهنية والبنكرياس والجلد والجهاز الدوري والجهاز العصبي المركزي ل T. brucei والجلد لسلالات الليشمانيا الجلدية ، والكبد والطحال ونخاع العظم لسلالات الليشمانيا اللزجة . لذلك فإن المنظور المكاني ضروري لفهم التسبب في مرض المثقبيات السوماتية. رسم الخرائط الكيميائية يولد تصورات 3D من وفرة جزيء صغير ولدت عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة – قياس الطيف الكتلي، بالمقارنة مع المعلمات الميكروبيولوجية والمناعية. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن تطبيق رسم الخرائط الكيميائي لدراسة العمليات المسببة للأمراض أثناء عدوى المثقبيات ، بدءا من أخذ عينات الأنسجة المنهجية واستخراج الأيض ، يليه اكتساب بيانات قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائلة ، وينتهي بتوليد خرائط 3D لتوزيع الأيض. يمكن استخدام هذه الطريقة لأسئلة بحثية متعددة ، مثل متطلبات المغذيات لاستعمار الأنسجة بواسطة T. cruzi أو T. brucei أو Leishmania ، والتمثيل الغذائي المناعي في مواقع العدوى ، والعلاقة بين اضطراب التمثيل الغذائي للأنسجة المحلية وأعراض المرض السريري ، مما يؤدي إلى نظرة شاملة على التسبب في مرض المثقبيات الدقيقة.
Introduction
تتكون طفيليات المثقبيات من أنواع الليشمانيا والمثقبيات الأفريقية (Trypanosoma brucei) والمثقبيات الأمريكية (Trypanosoma cruzi). تسبب الليشمانيا الأولية داء الليشمانيات، والذي يشمل الشفاء الذاتي وداء الليشمانيات الجلدي الموضعي المحدود ذاتيا، وداء الليشمانيات المخاطي الجلدي الذي تتلف فيه الأنسجة المخاطية للفم والأنف والحلق، وداء الليشمانيات الحشوي مع استوائية طفيليات إلى الأعضاء الحشوية التي تسبب الحمى وتضخم الكبد والطحال1،2. T. brucei يسبب داء المثقبيات الأفريقي البشري (HAT) ، المعروف أيضا باسم مرض النوم ، الذي يتم الإبلاغ عنه بشكل رئيسي في البلدان الأفريقية 3. تشمل العلامات والأعراض السريرية تضخم الكبد والطحال والحمى والصداع وآلام العضلات والعظام واعتلالات العقد اللمفاوية وفقر الدم في المرحلة الدموية اللمفاوية عندما تتركز الطفيليات في مجرى الدم والغدد الليمفاوية. ويتبع ذلك مرحلة السحايا والدماغ ، حيث تتركز الطفيليات في الجهاز العصبي المركزي وتسبب اضطرابات النوم والتغيير السلوكي ، وفي نهاية المطاف غيبوبة قاتلة4. T. cruzi يسبب مرض شاغاس ، المتوطن في الأمريكتين. يعاني الأفراد المصابون من مرحلة حادة أولية ، عادة ما تكون بدون أعراض ، مع استوائية طفيليات واسعة. يعاني حوالي 10٪ -30٪ من الأفراد المصابين من أعراض المرحلة المزمنة بعد عقود من العدوى ، والتي تتميز بتضخم المريء وتضخم القولون ومضاعفات القلب والأوعية الدموية5,6.
يدرس الأيض الأنواع الجزيئية الصغيرة (50-1500 Da) ، بما في ذلك المركبات البيولوجية من التمثيل الغذائي الأولي أو الثانوي والمركبات المشتقة من الخارج مثل الأدوية أو الجزيئات المشتقة من الطعام. في سياق التفاعلات بين المضيف والممرض ، يمكن أن تستكشف الأيض تأثير العدوى على بيئات مستقلب المضيف ، وهو أمر بالغ الأهمية في الوصول إلى تأثير العامل الممرض على المضيف. ويمكنه أيضا تقييم تكيفات مسببات الأمراض مع البيئة الغذائية والمناعية المضيفة7،8،9. يعد قياس الطيف الكتلي (MS) والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) من أدوات التمثيل الغذائي الشائعة المستخدمة لتحديد الأيضات وتحديدها كميا وتوصيفها. ويمكن أيضا تطبيق هذا النهج “omics” على اكتشاف المؤشرات الحيوية وتطوير الأدوية10،11.
بالنظر إلى استواء الأنسجة المحدد لطفيليات المثقبيات ، يمكن لتحليلات الأيض المكاني أن تمكن من الحصول على نظرة ثاقبة كبيرة في التسبب في الأمراض التي تسببها. كشف رسم خرائط التوزيع المكاني للمستقلبات عن مستقلبات متأثرة محليا بعدوى المثقبيات الكروزي المزمنة في أنسجة قلب الفأر وعدوى المثقبيات كروزي الحادة والطويلة الأجل في الجهاز الهضمي للفأر6،12،13. على وجه التحديد ، أظهر رسم الخرائط الكيميائي 3D انفصالا بين ثبات الطفيليات والتغيرات الأيضية في أنسجة القلب للفئران المصابة بداء المثقبيات المزمن. كان التمثيل الغذائي أكثر اضطرابا في الأجزاء السفلية والقمية من القلب ، مطابقا لمواقع أعراض مرض شاغاس (تمدد الأوعية الدموية القمي القلبي). تشمل عائلات الأيض التي تزعجها العدوى في مواقع قلبية محددة والمرتبطة بشدة المرض الأسيلكارنيتين والجلسروفوسفوكولينز12،13،14. في الجهاز الهضمي ، اتفقت التغيرات الأيضية المستمرة مع مواقع أعراض مرض شاغاس: المريء والقولون. في المقابل ، يتم إعادة تطبيع عملية التمثيل الغذائي في المواقع غير المرتبطة بأعراض مرض شاغاس ، مثل الأمعاء الدقيقة. تشمل المستقلبات التي تزعجها العدوى محليا في الجهاز الهضمي الأسيلكارنيتين والجلسروفوسفوكولين والكينورينين والتريبتوفان وحمض الكوليك. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت هذه التحليلات من تحديد آلية استقلابية جديدة للتسامح مع مرض شاغاس6. كشف تطبيق هذه الطرق على دراسة داء الليشمانيات الجلدي عن اضطرابات استقلابية كبيرة في موقع الآفة ، ولكن أيضا تغيرات استقلابية محددة في الأنسجة السليمة المجاور للآفة ، والمنظارية. على سبيل المثال ، تم استنفاد الجلوتامين في موقع الآفة ، في حين أن الجلسروفوسفوكولين في m / z (نسبة الكتلة إلى الشحنة) 200-299 و 400-499 و 500-599 و 600-699 زادت بشكل كبير في موقع الآفة. ولم يزد الكمبيوتر الشخصي (O-34:1) إلا في المواقع المجاورة للآفات15.
الهدف من هذه المخطوطة هو إظهار الخطوات اللازمة لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد لتوزيع الأيض (“رسم الخرائط الكيميائية”) كما هو مطبق على نماذج عدوى طفيليات المثقبيات (الشكل 1). يعتمد هذا النهج على العديد من التطورات الهامة في سياق الأيض ومعالجة بيانات الأيض ، ولا سيما تطوير برنامج ‘ili لرسم بيانات الأيض على نماذج ثلاثية الأبعاد بسهولة16.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد فهم عدوى المثقبيات الجسدية أمرا ضروريا لتوجيه تطوير الأدوية الجديدة وأساليب العلاج. وهذه الطريقة الكيميائية لرسم الخرائط مهيأة بشكل فريد لتوفير رؤى قابلة للتنفيذ حول العلاقة بين التمثيل الغذائي ومرض المثقبيات السوماتيد، وبالتالي تلبية هذه الحاجة الانتقالية.
يوصى فقط بمذيبات LC-MS أثناء استخراج الأيض وتحليلات MS ، لتقليل تلوث الخلفية. يجب تجنب التلوث البوليمري35 ، المشتق عادة من فيلم البارافين و / أو البلاستيك الآخر 36،37،38 ، حيثما أمكن ذلك. يجب ألا يتم استخدام Parafilm ، على وجه الخصوص ، أبدا. هذه الجوانب حاسمة لأن جودة بيانات LC-MS تعتمد على المواد المستخدمة أثناء إعداد العينات واستخراج الأيض. يجب ضمان جودة البيانات قبل إنشاء مخططات ‘ili. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب إنشاء خرائط الأيض المكانية الشاملة هذه جمع جميع عينات الأنسجة المجاورة واستخراج الأيض من جميع العينات التي تم جمعها لتجنب الفجوات في هذه الخرائط. وبالتالي ينبغي النظر في إجراءات الجمع والخدمات اللوجستية لاستخراج الأيض وتحليل LC-MS والتكاليف والتخطيط لها وفقا لذلك.
يمكن تعديل هذا البروتوكول لتلبية احتياجات المستخدم بطرق متعددة. على سبيل المثال، ستؤثر قطبية وقابلية ذوبان المذيبات المستخدمة أثناء استخراج الأيض على المستقلبات المكتشفة39. ولزيادة تنوع خصائص المستقلب المكتشفة لتحليلات رسم الخرائط الكيميائية غير المستهدفة، يوصى بالجمع بين خطوات استخراج متعددة ومذيبات. على سبيل المثال ، تستخدم هذه الطريقة ثنائي كلورو الميثان والميثانول والماء كمذيبات استخراج لأنها تمكن من الكشف الدقيق عن الجزيئات غير القطبية والقطبية20,40. ومع ذلك ، فإن هذه المذيبات ليست مناسبة عالميا لكل تجربة MS ، ويجب على الباحثين اختيار مذيبات الاستخراج بناء على أهداف مشروعهم. وبالمثل ، يمكن استخدام ظروف LC-MS / MS المختلفة ، مثل استبدال كروماتوغرافيا الطور المعكوس بكروماتوغرافيا الطور العادي. يمكن أيضا استخدام أعمدة بديلة لجمع بيانات الطور المعكوس بدلا من كروماتوغرافيا C8 ، على الرغم من أن كروماتوغرافيا C8 تجريبيا أكثر قوة لدهون الأنسجة ولها تردد انسداد أقل. من الناحية المفاهيمية ، يمكن أيضا تطبيق هذه البروتوكولات على طرق قياس الطيف الكتلي الأخرى مثل كروماتوغرافيا الغاز – مطياف الكتلة ، إلخ.
وهناك نهج بديل هو التصوير الطيفي الكتلي. والواقع أنه خلافا لنهج التصوير الطيفي الكتلي، فإن قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل لا يحافظ بطبيعته على المعلومات المكانية10. وتعمل نهج رسم الخرائط الكيميائية على سد هذه الفجوة عن طريق إدراج موقع أخذ العينات في وقت وضع تصور للمشروع، وفي البيانات الوصفية للعينة، وفي خطوات معالجة البيانات. وتتمثل إحدى نقاط قوة نهج رسم الخرائط الكيميائية هذا، على عكس التصوير الطيفي الكتلي، في القدرة على تقديم تعليقات توضيحية واثقة (مبادرة معايير الأيض من المستوى 1 أو المستوى 2 من الثقة في التعليقات التوضيحية41)، على عكس التصوير الطيفي الكتلي حيث يعتمد الجزء الأكبر من التطبيقات على الكتلة الدقيقة فقط للتعليق التوضيحي. سيمكن التصوير الطيفي الكتلي من رسم الخرائط المكانية الدقيقة الحبيبات ، وأحيانا وصولا إلى مستوى الخلية الواحدة ، على سبيل المثال ، 42،43. وعلى النقيض من ذلك، تتيح نهج رسم الخرائط الكيميائية رسم خرائط واسعة النطاق عبر الأعضاء لتوزيع المستقلب دون الحاجة إلى مهارات عالية التخصص في الاستئصال بالتبريد للحيوانات بأكملها. يوفر رسم الخرائط الكيميائية أدلة تكميلية للعديد من مناهج النسخ المكاني التي يجري تطويرها، على سبيل المثال، 44، مع ميزة التركيز على “طبقة omics الأقرب إلى النمط الظاهري”45. وتشمل الطرق البديلة لتحديد كمية حمل الطفيليات قياس التلألؤ الأحيائي في وقت جمع العينات6. ويمكن أيضا جمع الأجزاء الدقيقة لتمكين المجهر البؤري أو الإلكتروني من تقييم عبء الطفيليات الموضعية وتلف الأنسجة. ويمكن أيضا استخدام تجانس الماء، الذي يستخدم لقياس كمية السيتوكين في هذا البروتوكول والمنشورات السابقة13، لتحديد العلامات القائمة على البروتين لتلف الأنسجة.
هناك أيضا طرق متعددة للحصول على نماذج 3D مناسبة لرسم بيانات LC-MS الناتجة. بالإضافة إلى الطريقة المقترحة هنا ، يمكن شراء النماذج مسبقة الصنع من مختلف البائعين عبر الإنترنت. التأكد من تطابق شروط الاستخدام مع الاستخدام المقصود، خاصة فيما يتعلق بالنشر. يمكن إنشاء نماذج للأعضاء الكبيرة de novo باستخدام الماسحات الضوئية 3D وفقا لتعليمات الماسح الضوئي. توجد بدائل مثل MATLAB لتوليد وتصور نماذج ثلاثية الأبعاد لرسم الخرائط الكيميائية46 ، ولكن تم تنفيذها في المقام الأول قبل تطوير ‘ili16. MATLAB هي مجموعة أدوات تحليل البيانات والبرمجة التي تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في العديد من المجالات. ومع ذلك ، فإن MATLAB ليس مجانيا ولا مفتوح المصدر ، ويتطلب الإلمام بواجهات MATLAB ، خاصة بالنظر إلى أن MATLAB لم يتم تطويره لمعالجة بيانات قياس الطيف الكتلي. بدائل هذه الطريقة المقترحة ، وهي SketchUp و Meshlab و ‘ili ، يمكن الوصول إليها بحرية وسهلة الاستخدام وتقدم وظائف مماثلة ل MATLAB لأغراض رسم الخرائط الكيميائية.
هذه الطريقة قوية فيما يتعلق بإعداد العينات واستخراج الأيض. غالبا ما يكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروريا في خطوة الحصول على بيانات LC-MS. هذا خارج نطاق هذه المقالة. يتم توجيه القراء إلى منشورات ممتازة حول استكشاف أخطاء الحصول على بيانات LC-MS وإصلاحها ، بما في ذلك 20,47. وبالمثل ، فإن تعقيدات التعليق التوضيحي للمستقلب تتجاوز نطاق تركيز هذه الطريقة على توليد نموذج 3D. تشمل المراجع المفيدة حول هذا الموضوع 24,25,48,49.
في حين أن هذه الطريقة تستكشف بشكل فعال التسبب في المرض ، إلا أن هناك قيودا على هذا النهج ، بعضها شائع في أي تجربة استقلاب. ويتمثل أحد هذه القيود في انخفاض معدل التعليقات التوضيحية لميزات LC-MS50، التي تتوقف على توافر المكتبات الطيفية المرجعية وجودتها. وهناك قيد آخر هو أن هذا البروتوكول لا يحافظ على الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب عدم توافق كواشف الحفاظ على الحمض النووي الريبي مثل الحمض النووي الريبي في وقت لاحق مع تحليل LC-MS/MS. ومع ذلك ، فإن جودة البروتين كافية للتحليلات النهائية وبالتالي يمكن أن تحل محل التحليلات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال.
يعكس نهج رسم الخرائط الكيميائية لمسببات العدوى بشكل مباشر كيفية تطور العدوى البكتيرية أو الفيروسية أو الطفيلية في أنظمة الأعضاء وتسبب المرض الموضعي. تحليل هذه العينات الفرعية الإقليمية وتوليد نماذج 3D ينقل في نهاية المطاف كيف تعمل المستقلبات عبر الفضاء ثلاثي الأبعاد ، مما يلقي الضوء على هذه الأبعاد المكانية غير المعترف بها سابقا للبيولوجيا الجزيئية. باستخدام هذا البروتوكول ، على سبيل المثال ، تمت مقارنة توطين الأيض بحمل طفيلي Trypanosoma cruzi. أوضحت النتائج العلاقة بين العامل الممرض والأنسجة المضيفة وأظهرت أيضا ديناميكيات التمثيل الغذائي لتطور أعراض مرض شاغاس6. كما تم تطبيق أساليب رسم الخرائط الكيميائية على مواضيع مختلفة، مثل التفاعل البيئي الذي بناه الإنسان51،52،53، والتركيب الكيميائي لأنظمة الأعضاء مثل جلد الإنسان46 والرئتين54، واستقلاب النبات والتفاعلات البيئية55. يمكن أن تتضمن التطبيقات المستقبلية تقييم تحمل الأمراض المحلية ومرونتها ، أو العلاقة بين مستويات الأيض المحلية ، ومدار مسببات الأمراض ، ومدار المرض في نماذج تتجاوز عدوى المثقبيات الدقيقة. يجب أن يكون لهذا النهج أيضا قابلية تطبيق واسعة لتوسيع بروتوكولات الحرائك الدوائية الحالية ، لتقييم العلاقة بين مستويات أدوية الأنسجة المحلية واستقلاب الدواء مقابل السياق الأيضي العام ، وتلف الأنسجة ، وإزالة مسببات الأمراض. بشكل عام ، يسمح رسم الخرائط الكيميائية باستكشافات فريدة لتوزيعات الأيض في أنواع مختلفة من العينات ، مع تطبيقات تشمل التسبب في الأمراض ، وصحة الإنسان ، والتفاعلات بين الإنسان والبيئة ، والديناميات الميكروبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لورا إيزوبيل ماكول ، دكتوراه ، حاصلة على جائزة المحققين في التسبب في الأمراض المعدية من صندوق بوروز ويلكوم. كما يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من رقم جائزة المعاهد الوطنية للصحة R21AI148886 ، وهي منحة تجريبية من مركز أوكلاهوما للأمراض التنفسية والمعدية (OCRID) تحت رقم جائزة المعاهد الوطنية للصحة P20GM103648 ، وصناديق بدء التشغيل من جامعة أوكلاهوما (إلى LIM). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للممولين. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مطوري الأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. وقد تم الاستشهاد بجميع المنشورات ذات الصلة، حيثما ينطبق ذلك.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
References
- McCall, L. -. I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
- McCall, L. -. I., Zhang, W. -. W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
- de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
- Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
- Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
- Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
- Parab, A. R., McCall, L. -. I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
- Lewis, C. M., McCall, L. -. I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
- Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
- Newsom, S. N., McCall, L. -. I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
- Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, 521-526 (2007).
- Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
- McCall, L. -. I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
- Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
- Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
- Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and ‘ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
- McCall, L. -. I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
- Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
- Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
- Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
- Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Nothias, L. -. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
- Sturm, M., et al. OpenMS – an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- . FBMN with MZmine Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021)
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
- Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
- Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
- Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
- Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
- Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
- Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
- Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
- Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
- Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
- Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
- Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
- Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
- McCall, L. -. I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
- Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
- Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).
