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Immunology and Infection

Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Published: January 21, 2022
doi:
10.3791/63255
, , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research,University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology,University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology,University of Oklahoma, Norman

Summary

Este protocolo describe los pasos para generar un modelo 3D de distribución de metabolitos durante la infección por tripanosomátidos, incluida la recolección de muestras, la extracción de metabolitos, una descripción general de la cromatografía líquida-adquisición de datos de espectrometría de masas en tándem, generación de modelos 3D y, finalmente, visualización de datos.

Abstract

El tropismo de patógenos y el tropismo de la enfermedad se refieren a las ubicaciones de los tejidos colonizados o dañados selectivamente por patógenos, lo que lleva a síntomas de enfermedad localizados. Los parásitos tripanosomátidos infecciosos humanos incluyen Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas; Trypanosoma brucei, el agente causal de la enfermedad del sueño; y especies de Leishmania , agentes causantes de la leishmaniasis. Conjuntamente, afectan a 20 millones de personas en todo el mundo. Estos parásitos muestran tropismo específico: corazón, esófago, colon para T. cruzi, tejido adiposo, páncreas, piel, sistema circulatorio y sistema nervioso central para T. brucei, piel para cepas de Leishmania dermópicas e hígado, bazo y médula ósea para cepas viscerotrópicas de Leishmania . Por lo tanto, una perspectiva espacial es esencial para comprender la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida. La cartografía química genera visualizaciones en 3D de la abundancia de moléculas pequeñas generadas a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas, en comparación con los parámetros microbiológicos e inmunológicos. Este protocolo demuestra cómo la cartografía química se puede aplicar para estudiar los procesos patógenos durante la infección por tripanosomátidos, comenzando por el muestreo sistemático de tejidos y la extracción de metabolitos, seguido de la adquisición de datos de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, y concluyendo con la generación de mapas 3D de distribución de metabolitos. Este método se puede utilizar para múltiples preguntas de investigación, como los requisitos de nutrientes para la colonización de tejidos por T. cruzi, T. brucei o Leishmania, el inmunometabolismo en los sitios de infección y la relación entre la perturbación metabólica del tejido local y los síntomas clínicos de la enfermedad, lo que lleva a una visión integral de la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida.

Introduction

Los parásitos tripanosomátidos consisten en especies de Leishmania, tripanosomas africanos (Trypanosoma brucei) y tripanosomas americanos (Trypanosoma cruzi). Los protozoos de Leishmania causan leishmaniasis, que incluye leishmaniasis cutánea localizada autocurativa y autolimitada, leishmaniasis mucocutánea en la que los tejidos de la mucosa de la boca, nariz y garganta se dañan, y leishmaniasis visceral con tropismo parásito a los órganos viscerales que causa fiebre y hepatoesplenomegalia1,2. T. brucei causa tripanosomiasis africana humana (HAT), también conocida como enfermedad del sueño, reportada principalmente en países africanos3. Los signos y síntomas clínicos incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, dolor de cabeza, dolores musculoesqueléticos, linfadenopatías y anemia en la etapa hemolinfática cuando los parásitos se localizan en el torrente sanguíneo y los linfáticos. A esto le sigue la etapa meningo-encefalítica, donde los parásitos se localizan en el sistema nervioso central y causan trastornos del sueño, alteración del comportamiento y, finalmente, comas fatales4. T. cruzi causa la enfermedad de Chagas, endémica en las Américas. Los individuos infectados experimentan una etapa aguda inicial, generalmente asintomática, con un amplio tropismo del parásito. Alrededor del 10%-30% de los individuos infectados experimentan síntomas crónicos en etapa después de décadas de infección, caracterizados por megaesófago, megacolon y complicaciones cardiovasculares5,6.

Metabolómica estudia pequeñas especies moleculares (50-1.500 Da), incluidos compuestos biológicos del metabolismo primario o secundario y compuestos derivados externamente, como medicamentos o moléculas derivadas de alimentos. En el contexto de las interacciones huésped-patógeno, la metabolómica puede explorar el impacto de la infección en los entornos de metabolitos del huésped, crucial para acceder al efecto del patógeno en el huésped. También puede evaluar las adaptaciones de patógenos al entorno nutricional e inmunológico del huésped7,8,9. La espectrometría de masas (EM) y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) son herramientas metabolómicas comunes utilizadas para identificar, cuantificar y caracterizar metabolitos. Este enfoque “ómico” también se puede aplicar al descubrimiento de biomarcadores y al desarrollo de fármacos10,11.

Dado el tropismo tisular específico de los parásitos tripanosomátidos, los análisis metabolómicos espaciales pueden permitir una visión significativa de la patogénesis de las enfermedades que causan. El mapeo de la distribución espacial de los metabolitos reveló metabolitos afectados localmente por infección crónica por Trypanosoma cruzi en el tejido cardíaco del ratón e infección aguda y a largo plazo por Trypanosoma cruzi en el tracto gastrointestinal del ratón6,12,13. Específicamente, la cartografía química 3D demostró una desconexión entre la persistencia del parásito y las alteraciones metabólicas en el tejido cardíaco de ratones infectados crónicamente con Trypanosoma cruzi. El metabolismo fue más perturbado en los segmentos inferiores y apicales del corazón, coincidiendo con los sitios de los síntomas de la enfermedad de Chagas (aneurismas apicales cardíacos). Las familias de metabolitos perturbadas por la infección en sitios cardíacos específicos y correlacionadas con la gravedad de la enfermedad incluyen acilcarnitinas y glicerofosfocolinas12,13,14. En el tracto gastrointestinal, las alteraciones metabólicas persistentes coincidieron con los sitios de los síntomas de la enfermedad de Chagas: esófago y colon. Por el contrario, el metabolismo se vuelve a normalizar en sitios no asociados con los síntomas de la enfermedad de Chagas, como el intestino delgado. Los metabolitos localmente perturbados por la infección en el tracto gastrointestinal incluyen acilcarnitinas, glicerofosfocolinas, quinurenina, triptófano y ácido cólico. Además, estos análisis permitieron identificar un nuevo mecanismo metabólico de tolerancia a la enfermedad de Chagas6. La aplicación de estos métodos al estudio de la leishmaniasis cutánea reveló perturbaciones metabólicas significativas en el sitio de la lesión, pero también cambios metabólicos específicos en el tejido macroscópicamente sano adyacente a la lesión. Por ejemplo, la glutamina se agotó en el sitio de la lesión, mientras que las glicerofosfocolinas en el m /z (relación masa-carga) 200-299, 400-499, 500-599 y 600-699 aumentaron significativamente en el sitio de la lesión. La PC (O-34:1) sólo aumentó en los sitios adyacentes a la lesión15.

El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos necesarios para generar modelos 3D de distribución de metabolitos (“cartografía química”) aplicados a modelos de infección por parásitos tripanosomátidos (Figura 1). Este enfoque se basa en varios avances críticos en el contexto del procesamiento de datos metabolómicos y metabolómicos, en particular el desarrollo de software ‘ili para trazar datos metabolómicos en modelos 3D fácilmente16.

Protocol

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por la Universidad de Oklahoma o el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Diego. Todos los pasos para el manejo de material infeccioso se realizaron dentro de un gabinete de bioseguridad (clase II, tipo A2) y de acuerdo con las regulaciones locales. 1. Recolección de tejidos Infectar modelos animales apropiados de infección por tripanosomátidos, generalmente ratones o hámsteres.NOTA: Existe una variedad considerable de modelos de ratón para la infección por tripanosomátidos, dependiendo de los síntomas deseados que se producirán, la velocidad de progresión de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, etc. Los usuarios pueden elegir a su conveniencia. Para los modelos de infección por leishmaniasis cutánea, infectar por vía subcutánea en la almohadilla del pie o por vía intradérmica en el oído15. Para los modelos de infección por leishmaniasis visceral, infectar por vía intravenosa1,17. Para los modelos de enfermedad de Chagas e infección por enfermedad del sueño, infectar por vía intraperitoneal6,12,18,19. Determine la dosis de parásitos a usar en función de la cepa del parásito y los puntos de tiempo planificados. Planificar posiciones de seccionamiento. Planifique generar secciones con un mínimo de 10 mg de tejido por sección. Es mejor usar 30-50 mg. Para los modelos de infección por enfermedad de Chagas, planee recolectar segmentos cardíacos y gastrointestinales sistemáticamente. Para los modelos de infección cutánea por leishmaniasis, recoja muestras de tejido lesional y adyacentes a la lesión. Para los modelos de infección por leishmaniasis visceral, planee recolectar bazo y múltiples lóbulos hepáticos. Los sitios de tejido adicionales, como el tejido adiposo, también pueden ser de interés para recolectar.PRECAUCIÓN: Las muestras de animales infectados deben manipularse bajo el protocolo de bioseguridad apropiado y aprobado institucionalmente. Esto generalmente implicará requisitos de equipo de protección personal (EPP) y solo abrirá tubos y recolectará muestras dentro de un gabinete de bioseguridad (clase II, tipo A2). Etiquetar y pesar tubos para homogeneización. Utilice el tipo de tubo apropiado para el sistema de homogeneización disponible. Para un TissueLyser, use tubos de microcentrífuga de 2 ml. Sacrificar ratones en los puntos de tiempo de infección deseados utilizando una sobredosis de isoflurano según lo aprobado por la IACUC institucional o de acuerdo con el protocolo aprobado por la IACUC. Sección de tejido sistemáticamente según lo planeado, con una sección por tubo. Recuerde lavar el equipo de recolección de muestras entre muestras con disolvente de extracción (50% de metanol en este protocolo). Manteniendo la tapa del tubo abierta, inmediatamente congele las muestras en nitrógeno líquido.PRECAUCIÓN: No cierre los tubos hasta que el nitrógeno líquido que ingresó al tubo se haya evaporado por completo para evitar que los tubos exploten a medida que el nitrógeno se expande. Tome las medidas adecuadas para asegurarse de que la piel no entre en contacto con el nitrógeno líquido (use guantes criogénicos y fórceps para sujetar los tubos). Use un protector facial de seguridad. Guarde los tubos en hielo seco hasta que se hayan recogido todas las muestras deseadas. Punto de pausa: almacene las muestras a -80 °C hasta que estén listas para realizar las extracciones. Pesar los tubos para determinar el peso de la muestra de tejido. Grabar en una hoja de cálculo. Mantenga las muestras congeladas durante el proceso de pesaje: mantenga los tubos en hielo seco, pese rápidamente, vuelva a colocarlos en hielo seco de inmediato. No permita que las muestras se descongelen durante el pesaje. 2. Extracción de metabolitos NOTA: Solo se deben usar líquidos y reactivos de grado LC-MS en todas partes. Este método fue adaptado de Reference20. Prepare todos los disolventes de extracción (LC-MS grado H2O, LC-MS grado metanol, con 4 μM de sulfaclorpiridazina, diclorometano de grado LC-MS: metanol con 2 μM de sulfaclorpiridazina) en botellas de vidrio de 1 L, utilizando cristalería dedicada.NOTA: El volumen a preparar debe calcularse en función de los pesos de la muestra, considerando 500 μL de agua por 50 mg de muestra, 500 μL de metanol con un pico de 4 μM de sulfaclorpiridazina por 50 mg de muestra y 1.000 μL de diclorometano prechillado: metanol con un pico de 2 μM de sulfaclorpiridazina por 50 mg de muestra, aumentando el volumen calculado en un 10% para permitir la inexactitud del pipeteo. Almacene el disolvente de extracción a 4 °C al menos durante la noche para preenfriarlo. Realice la homogeneización a base de agua de las muestras de tejido según los pasos que se mencionan a continuación. Agregue una cuenta de acero inoxidable de 5 mm (consulte la Tabla de materiales) a cada uno de los tubos de microcentrífuga de 2 ml que contienen muestras de tejido, utilizando un dispensador de cuentas. Mantenga los tubos en hielo. Haga un tubo en blanco que contenga LC-MS grado H2O que pasará por todos los pasos y servirá como un espacio en blanco de extracción. Utilice el volumen promedio de H2O de las extracciones de muestras. Agregue LC-MS H2O de grado LC-MS refrigerado a las muestras de tejido congelado. Normalice el volumen de agua al peso del tejido agregando 500 μL de agua / 50 mg de muestra, utilizando los pesos de muestra calculados en el paso 1.7.PRECAUCIÓN: Si manipula muestras biopeligrosas, continúe siguiendo el protocolo de bioseguridad apropiado y aprobado institucionalmente. Esto generalmente implicará requisitos para el equipo de protección personal (EPP) y los tubos de apertura solo dentro del gabinete de bioseguridad (clase II, tipo A2). Homogeneizar muestras a una velocidad de 25 Hz durante 3 min utilizando un homogeneizador de tejidos (ver Tabla de Materiales). Cierre los tubos herméticamente para evitar derramar los reactivos durante el procesamiento. Recolectar aproximadamente 1/10 del volumen de homogeneización para la extracción de ADN, qPCR, análisis basados en proteínas u otros análisis (si se desea). Almacenar en un tubo de microcentrífuga o en una placa de 96 pocillos (dependiendo del volumen recogido) durante un máximo de 6 meses a -80 °C, si los experimentos de extracción de ADN se van a realizar en un día diferente. Es posible que haya duraciones de almacenamiento más largas, pero no se han probado. Realice extracciones de ADN utilizando cualquier kit comercial estándar para la extracción de ADN de mamíferos (consulte la Tabla de materiales) de tejidos como se describe en la Referencia13. Cuantificar el rendimiento de ADN y almacenar el ADN extraído a -20 °C. La cantidad y calidad aceptables de ADN para qPCR se han observado incluso hasta 3 años después.NOTA: Este paso se puede realizar en homogeneizado congelado en un día posterior a la extracción del metabolito. Realice qPCR como se describe en la Referencia13, utilizando 180 ng de ADN extraído.NOTA: Esto se puede realizar en ADN recolectado en un día anterior y congelado a -20 ° C. En el caso de los estudios sobre la infección por T. cruzi , utilizar los siguientes cebadores: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA y AATTCCTCCAAGCAGCGGATA para cuantificar los niveles del parásito21 y los siguientes cebadores para normalizar los niveles de ADN del huésped: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA y CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 ( ver Tabla de Materiales).NOTA: Los ciclos de qPCR recomendados son los siguientes: desnaturalización a 95 °C durante 10 min; realizar 40 ciclos a 95 °C durante 30 s, y luego 58 °C durante 60 s, y finalmente 72 °C durante 60 s. Realice el análisis de la curva de fusión según corresponda para el termociclador disponible. Procesar datos utilizando el método ΔΔCt23 para obtener la carga relativa de parásitos entre los sitios de muestreo. La cuantificación absoluta se puede obtener comparando los valores de ΔΔCt derivados de la muestra con una curva estándar generada a partir de cantidades conocidas de parásitos, entubados en muestras de tejido no infectado y extraídos como en los pasos 2.2 a 2.2.4.1. Realizar la caracterización basada en proteínas de las respuestas inmunes utilizando kits de citoquinas multiplexadas o kits ELISA comerciales estándar (ver Tabla de Materiales) como se describe en la Referencia13 sobre el homogeneizado almacenado. Ahorre al menos la mitad de los 500 μL del volumen de homogeneización para la extracción de metabolitos. Realizar extracción de metabolitos acuosos.NOTA: La selección de disolventes se puede adaptar en función de las propiedades químicas de los metabolitos de interés. Agregue metanol helado de grado LC-MS con 4 μM de sulfaclorpiridazina al homogeneizado para lograr una concentración final de metanol al 50% con 2 μM de sulfaclorpiridazina en agua.PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y peligroso. Use los procedimientos de seguridad apropiados, incluida la manipulación dentro de una campana extractora de humos o un gabinete de bioseguridad. Homogeneizar muestras en un homogeneizador de tejido a una velocidad de 25 Hz durante 3 min. Muestras de centrífugas a 16.000 x g a 4 °C durante 10 min. Recoge un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos. Seleccione el volumen para que coincida con el volumen más pequeño de metanol + agua combinado en todas las muestras. Esta es la fracción acuosa. Deje de lado cualquier sobrenadante homogenado acuoso restante a -80 °C como respaldo. Mantenga el residuo sólido en hielo mientras recoge los sobrenadantes. Sobrenadante de extracción acuosa seca hasta que se seque (~3 h o durante la noche). Use la velocidad máxima y sin calefacción. Congele la placa seca de 96 pocillos a -80 °C. Realizar extracción de metabolitos orgánicos.NOTA: La selección de disolventes se puede adaptar en función de las propiedades químicas de los metabolitos de interés. Añadir 1.000 μL por 50 mg de la muestra de diclorometano prechileado: metanol con 2 μM de sulfaclorpiridazina al residuo sólido de la etapa 2.3.4.PRECAUCIÓN: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados al manipular disolventes, incluida la manipulación dentro de una campana extractora de humos con un buen caudal. Homogeneizar muestras en un homogeneizador de tejido a una velocidad de 25 Hz durante 5 min. Centrifugar las muestras a 16.000 x g a 4 °C durante 10 min. Recoge un volumen igual de sobrenadante en una placa de 96 pocillos. Seleccione el volumen para que coincida con el volumen más pequeño de diclorometano: metanol, en todas las muestras. Esta es la fracción orgánica. Almacene el pellet a -80 °C como respaldo. Guarde el extracto orgánico restante a -80 °C como respaldo. Seque al aire el extracto orgánico en una campana de humos durante la noche. Congele la placa seca de 96 pocillos a -80 °C. 3. Adquisición de datos LC-MS Resuspend extractos acuosos y orgánicos en 60 μL cada uno de 50% de metanol + 2 μM de sulfadimetoxina, y combinar. Sonicar durante 10 min; luego, centrifugar durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a una placa limpia de 96 pocillos. Selle con un sello de placa sin zona y coloque la placa en un muestreador automático LC.PRECAUCIÓN: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados al manipular disolventes, incluida la manipulación dentro de una campana extractora de humos con un buen caudal. Conecte las fases móviles apropiadas al sistema LC (consulte la Tabla de materiales).NOTA: Para lc de fase inversa en modo positivo, los autores recomiendan H2O + ácido fórmico de grado LC-MS + 0.1% como fase A móvil y acetonitrilo de grado LC-MS + ácido fórmico de grado LC-MS como fase B móvil con un caudal de 0.5 mL / min y un gradiente LC de 7.5 min. Los pasos de gradiente recomendados son los publicados en la Referencia6: 0-1 min, 2% B; 1-2.5 min, aumento lineal al 98% B; 2.5-4.5 min, mantener en 98% B; 4.5-5.5 min, disminución lineal a 2% B; 5.5-7.5 min, mantener en 2% B. Asegúrese de que el instrumento esté limpio. CalibraR MS tanto en modo positivo como negativo. Realizar la evaluación del desempeño de la EM según corresponda para el instrumento. Cree una secuencia de ejecución de MS. Comience con 2 espacios en blanco, 2 estándares (6 mezclas) y 5 controles de calidad agrupados (QC) en una serie de dilución, comenzando con 2 μL de volumen de inyección y aumentando paso a paso a 30 μL de volumen de inyección. Aleatorice el orden de la muestra. Después de cada 12 muestras, ejecute un espacio en blanco y luego un control de calidad agrupado. Conecte la columna C8 LC (tamaño de partícula de 1,7 μm, tamaño de poro de 100 Å, longitud de 50 x 2,1 mm x diámetro interno) y supervise las fugas y la contrapresión excesiva. Solucionar problemas según el procedimiento operativo estándar del instrumento. Inicie la secuencia de ejecución de MS y recopile datos LC-MS/MS dependientes de datos.NOTA: Para un instrumento Q-Exactive Plus MS, utilice la ionización por electropulverización calentada y la adquisición de MS2 dependiente de datos (top 5) en modo positivo, una resolución de 70,000 para MS1 y 17,500 para MS2, AGC Target de 1E6 para MS1 y 2E5 para MS2, TI máxima de 100 ms para MS1 y MS2, rango de escaneo a 100-1500 m / z para MS1, y ventana de aislamiento MS2 de 1 m/z. Ajuste el gas de la vaina a 35, el gas auxiliar a 10 y el gas de barrido a 0, el voltaje de pulverización a 3.8 kV, la temperatura capilar a 320 ° C, el nivel de RF de la lente S a 50 y la temperatura del gas auxiliar a 350 ° C. Verifique la calidad de los datos: verifique los espacios en blanco iniciales (confirme la falta de picos principales), los estándares (confirme la presencia de picos esperados y la forma simétrica del pico) y los QC (confirme la presencia de picos esperados, la forma del pico y la intensidad máxima esperada). Supervise periódicamente la ejecución de MS durante la secuencia de ejecución. Una vez finalizada la ejecución, verifique los datos en busca de inyecciones perdidas u otros errores. Guarde la columna LC según lo recomendado por el fabricante. Retirar y conservar las muestras a -80 °C. Cargue datos sin procesar en el repositorio de datos.NOTA: Se recomienda MassIVE (massive.ucsd.edu) para habilitar el enlace descendente a la red molecular para anotaciones de metabolitos24,25. 4. Procesamiento de datos LC-MS Convierta archivos raw a formato abierto (.mzXML o .mzML) con MSConvert26. Cargue datos sin procesar y datos mzXML o mzML en el repositorio de datos. Generar tabla de características. Existen múltiples herramientas para hacerlo (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, etc.27,28,29,30).NOTA: MZmine se recomienda porque es gratuito, de código abierto y puede importar directamente archivos mzXML después de MSconvert, tiene opciones de interfaz gráfica de usuario para procesar datos y monitorear el impacto de la selección de parámetros, y puede exportar directamente a GNPS para redes moleculares24.NOTA: Siga la documentación de la herramienta y utilice los parámetros apropiados para el instrumento disponible. También se pueden encontrar detalles adicionales en Reference31. Exportar tabla de características en formato .csv. 5.3D generación de modelos Dibuje a mano el modelo 3D de novo a escala según los pasos que se mencionan a continuación. Tome una foto del órgano de interés. Realice lo siguiente en el software SketchUp (consulte la Tabla de materiales) como se menciona a continuación. Elimine la imagen predeterminada de un hombre que aparece cuando se abre el software. Haga clic en Archivo > Importar para importar una imagen de los órganos de interés. Haga clic en la herramienta Líneas y seleccione la opción A mano alzada . Utilice la herramienta del lápiz para trazar y dibujar los contornos de los órganos de interés. Asegúrese de cerrar la línea dibujando todo el camino de regreso al punto de partida. Una vez que la línea se haya cerrado correctamente, el área dibujada aparecerá automáticamente sombreada. Seleccione la herramienta Push/Pull y tire hacia arriba en el área sombreada para convertir el dibujo de 2D a 3D. Eliminar la imagen del órgano: seleccione el botón Borrador y, a continuación, haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Borrar. Exporte el archivo en formato .dae: Archivo > Exportar > modelo 3D. Mejore el realismo del modelo según los pasos que se mencionan a continuación. Importe el modelo en el software MeshLab (consulte Tabla de materiales): abra MeshLab y seleccione Archivo > Importar malla. Seleccione el modelo .dae generado en el paso anterior. Aparecerá un menú Opciones previas a la apertura. Seleccione Aceptar. Seleccione Wireframe en el menú superior. A continuación, seleccione: Filtros > Superficies de remeshing, simplificación y reconstrucción > subdivisión: punto medio. Deje todos los valores como predeterminados y seleccione Aplicar dos veces. Inspeccione visualmente la vista de estructura metálica del modelo para asegurarse de que está finamente cuadriculada. Cierre el menú emergente. Exporte el modelo en formato .stl: Archivo > Exportar malla como y, a continuación, seleccione Formato de archivo STL (*.stl) en el menú desplegable Archivos de tipo . Haga clic en Guardar. Seleccione Aceptar en el siguiente menú emergente. Abra el software Meshmixer (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en el botón Importar (+ ). Seleccione el archivo .stl generado en el paso anterior. Utilice las herramientas Pinceles de > de escultura > Pinceles de > de arrastre y escultura > Inflar para extraer las superficies del modelo que deben redondearse. Una vez que el modelo tenga la apariencia deseada, guárdelo en formato .stl: Archivo > Exportar. Asigne al archivo el nombre que desee y seleccione Formato binario STL (*.stl) en el menú desplegable Guardar como tipo. Haga clic en Guardar. Si aparece un menú emergente, haga clic en Continuar. 6. ‘ili generación de parcelas Obtener coordenadas para las posiciones en el modelo 3D que corresponden a los sitios de muestreo. Abra el modelo 3D desde el paso 5.1.3.5 en el software MeshLab : File > Import Mesh. Seleccione el modelo generado en el paso 5.1.3.5. Haga clic en Aceptar en la ventana emergente Procesamiento posterior a la apertura. Para obtener coordenadas x, y y z para cada punto de muestreo: seleccione la herramienta PickPoints y, a continuación, haga clic con el botón secundario a intervalos espaciados regularmente en la superficie del modelo 3D. Una vez que se hayan seleccionado todas las coordenadas deseadas, haga clic en el botón Guardar más alto en la ventana emergente Formulario .NOTA: Esto exportará las coordenadas en formato de archivo .pp. Este archivo se puede abrir en un software de hoja de cálculo. En el software de hoja de cálculo: Abra el archivo .pp generado en el paso 6.1.2. Ajustar la visualización de datos mediante Datos > Texto a Columnas > Delimitado. Haga clic en Siguiente, luego seleccione Espacio y haga clic en Finalizar. Cambie el formato para que solo queden valores numéricos en las celdas de la hoja de cálculo seleccionando Inicio > Buscar y seleccionar > Reemplazar. En el cuadro Buscar qué, escriba: y=”. Deje vacía la casilla Reemplazar con. Haga clic en Reemplazar todo y, a continuación, en Aceptar. Repita para x=” y para z=” y para ” />. Los valores ya están listos para el paso 6.2. Haga la tabla de características ‘ili. Este método fue adaptado de Reference16. En un software de hoja de cálculo, cree la tabla de características. Las filas corresponden a cada posición y las columnas a los datos.NOTA: Las primeras columnas deben ser el nombre de la posición (nombre de la muestra), seguido de las coordenadas x, y y z de los puntos de muestreo obtenidos en el paso 6.1.2 (con encabezados de columna x, y, z). La quinta columna debe titularse “radio”. Pegue los metadatos apropiados y la abundancia de características de metabolitos en las columnas de hoja de cálculo posteriores. En la columna “radio”, introduzca el tamaño deseado de los puntos de muestreo que se visualizarán en el modelo. Determine empíricamente los valores de radio: escriba 1 como predeterminado y, a continuación, evalúe si es necesario ajustar el radio o las coordenadas en el paso 6.3. Guarde el archivo en formato .csv (> Guardar como) y, a continuación, seleccione CSV (delimitado por comas) (*.csv) en el menú desplegable. Asigne al archivo el nombre que desee. Haga clic en Guardar. Abra los datos en ‘ili (software desarrollado por16). Abra el sitio web ‘ili (ili.embl.de). Seleccione Superficie. Arrastre y suelte el modelo 3D creado en la ventana del navegador. Arrastre y suelte la tabla de características creada en la misma ventana del navegador. Utilice la leyenda en la esquina inferior derecha para proyectar la columna de datos deseada en el modelo 3D. Asegúrese de que las manchas y los radios seleccionados en el paso 6.2.1 coincidan con los sitios de muestreo. Si es necesario, ajuste los valores en la tabla de entidades o elija coordenadas adicionales en MeshLab (consulte el paso 6.1.2).NOTA: La visualización también se puede mejorar seleccionando spots > opacidad de borde y configurando el control deslizante en su valor máximo. Seleccione consecutivamente cada columna de datos para evaluar la distribución de esta característica de metabolito en el modelo 3D.NOTA: Este enfoque también se puede utilizar para visualizar solo características específicas de metabolitos de interés, por ejemplo, aquellas con p < 0.05 o un cierto cambio de pliegue entre muestras infectadas y no infectadas, según lo determinado en herramientas de análisis estadístico externas. Las características para visualizar también se pueden seleccionar fuera de 'ili a través de enfoques de aprendizaje automático, como un bosque aleatorio. Realice una visualización de datos lineal / de registro según los pasos que se mencionan a continuación. Con la pestaña Asignación en la parte superior derecha de la página, seleccione Lineal o Logarítmico en el menú desplegable Escala . Establezca la misma escala para todas las gráficas si visualiza varias entidades.NOTA: El sitio web elige automáticamente el mínimo y el máximo para cada columna de datos que se mostrará. Para establecer la escala manualmente, anule la selección de la opción Auto Min/Max e introduzca la escala deseada. Todos los datos ahora se mostrarán dentro de la misma escala. Cambie la escala de color de los datos (escala de grises, azul-blanco-rojo, etc.). Cambie la escala de color a la combinación de colores deseada en el menú Asignación mediante el menú desplegable Mapa de colores . Asegúrese de que la combinación de colores seleccionada sea compatible con los daltónicos. Para cambiar el color del modelo 3D o el color de fondo, utilice las opciones Color y Fondo en el menú 3D. Para ocultar ejes 3D, anule la selección del cuadro Mostrar origen en el menú 3D. Guarde la imagen mediante capturas de pantalla, utilizando la herramienta de recorte, o la tecla de acceso directo Crtl + S para Windows o Linux y + S en OS X.

Representative Results

El número de características de metabolitos obtenidas depende del tipo de tejido analizado y de los parámetros de procesamiento de datos. Por ejemplo, este protocolo se ha utilizado para analizar el impacto espacial de la infección por T. cruzi en el metaboloma del tracto gastrointestinal en un modelo de ratón de infección por T. cruzi. En trabajos previos, los machos C3H/HeJ fueron inyectados intraperitonealmente con 1.000 CL + luc T. cruzi parásitos32,6. Los animales fueron sacrificados 12 u 89 días después de la infección, y se realizó un análisis de cartografía química de 13 segmentos contiguos del tracto gastrointestinal como se describe en este protocolo. Este análisis condujo a una tabla de características de 5.502 características, que luego se visualizaron en 3D utilizando los pasos descritos en este protocolo. Este enfoque permite la visualización de las características de los metabolitos en animales individuales que son altos en el sitio de alta carga parasitaria (quinurenina, Figura 2B vs. carga de parásitos, Figura 2A), de metabolitos con distribución diferencial entre regiones tisulares (glutamina, Figura 2C) y características de metabolitos que se encuentran en niveles comparables en los intestinos delgado y grueso (LPE 16: 0 Figura 2D ). La quinurenina fue seleccionada para su visualización debido a su conocida relación con la inflamación y publicaciones previas sobre la capacidad de los metabolitos derivados de la quinurenina para regular la carga de T. cruzi33. Los modelos aleatorios de aprendizaje automático basados en bosques habían revelado previamente una asociación entre los niveles de quinurenina y el estado de infección6. La glutamina fue seleccionada para una visualización basada en publicaciones anteriores que demostraban una relación entre la disponibilidad de glutamina in vitro y la sensibilidad al fármaco T. cruzi34. La distribución diferencial se confirmó mediante regresión logística, p < 0,05. LPE 16: 0 se seleccionó después de la inspección visual de los datos para descubrir las características de los metabolitos encontrados en niveles comparables en todos los sitios de tejido. Figura 1: Descripción general del protocolo. La ilustración fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Análisis de cartografía química. A los ratones machos C3H/HeJ se les inyectó por vía intraperitoneal 1.000 parásitos CL+luc T. cruzi32. Los animales fueron sacrificados 12 u 89 días después de la infección, y el tracto gastrointestinal fue recolectado y seccionado sistemáticamente (paso 1)6. Los metabolitos se extrajeron como en el paso 2 y se analizaron mediante LC-MS/MS.3D generación del modelo se realizó utilizando el software SketchUp (paso 5), y los datos se trazaron en 3D como en el paso 6. (A) Distribución del parásito en un ratón específico, 12 días después de la infección. (B) Distribución del metabolito de quinurenina en el mismo ratón, 12 días después de la infección. (C) Distribución media de glutamina entre ratones infectados, 89 días después de la infección. (D) Niveles comparables de m/z 454.292 tiempo de retención 2.929 min, anotados como 2-hexadecanil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (LPE 16:0), en el mismo ratón que en A y B en el intestino delgado y el colon. Se generaron muestras y datos en6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Comprender las infecciones por tripanosomátidos es esencial para guiar el desarrollo de nuevos fármacos y los enfoques de tratamiento. Este método de cartografía química está en una posición única para proporcionar información procesable sobre la relación entre el metabolismo y la patogénesis de la enfermedad tripanosomátida, abordando así esta necesidad traslacional.

Solo se recomiendan disolventes de grado LC-MS durante la extracción de metabolitos y los análisis de EM, para disminuir la contaminación de fondo. La contaminación polimérica35, comúnmente derivada de películas de parafina y/u otros plásticos36,37,38, debe evitarse siempre que sea posible. Parafilm, en particular, nunca debe usarse. Estos aspectos son cruciales ya que la calidad de los datos de LC-MS depende de los materiales utilizados durante la preparación de la muestra y la extracción de metabolitos. La calidad de los datos debe garantizarse antes de generar ‘ili plots. Además, la generación de estos mapas metabolómicos espaciales completos requiere la recolección de todas las muestras de tejido adyacentes y la extracción de metabolitos de todas las muestras recolectadas para evitar brechas en estos mapas. Por lo tanto, los procedimientos de recolección, la logística de la extracción de metabolitos y el análisis de LC-MS, y los costos deben considerarse y planificarse en consecuencia.

Este protocolo se puede modificar para satisfacer las necesidades del usuario de múltiples maneras. Por ejemplo, la polaridad y solubilidad de los disolventes utilizados durante la extracción de metabolitos influirá en qué metabolitos se detectan39. Para maximizar la diversidad de características de metabolitos detectados para análisis de cartografía química no dirigidos, se recomienda combinar múltiples pasos de extracción y solventes. Por ejemplo, este método utiliza diclorometano, metanol y agua como disolventes de extracción porque permiten la detección precisa de moléculas no polares y polares20,40. Sin embargo, estos solventes no son universalmente adecuados para todos los experimentos de EM, y los investigadores deben seleccionar los solventes de extracción en función de los objetivos de su proyecto. Del mismo modo, se pueden utilizar diferentes condiciones LC-MS / MS, como reemplazar la cromatografía de fase inversa con cromatografía de fase normal. Las columnas alternativas también se pueden usar para la recopilación de datos de fase inversa en lugar de la cromatografía C8, aunque empíricamente, la cromatografía C8 es más robusta a los lípidos tisulares y tiene una frecuencia de obstrucción más baja. Conceptualmente, estos protocolos también se pueden aplicar a otros métodos de espectrometría de masas como cromatografía de gases-espectrometría de masas, etc.

Un enfoque alternativo es la imagen de espectrometría de masas. De hecho, a diferencia de los enfoques de imágenes de espectrometría de masas, la cromatografía líquida-espectrometría de masas no preserva inherentemente la información espacial10. Los enfoques de cartografía química cierran esta brecha al incluir la ubicación del muestreo en el momento de la conceptualización del proyecto, en los metadatos de la muestra y en los pasos de procesamiento de datos. Una fortaleza de este enfoque de cartografía química, a diferencia de las imágenes de espectrometría de masas, es la capacidad de proporcionar anotaciones seguras (Metabolomics Standards Initiative nivel 1 o confianza de anotación de nivel 241), a diferencia de las imágenes de espectrometría de masas donde la mayor parte de las aplicaciones dependen de la masa precisa solo para la anotación. Las imágenes de espectrometría de masas permitirán un mapeo espacial de grano fino, a veces hasta el nivel de una sola célula, por ejemplo,42,43. Por el contrario, los enfoques de cartografía química permiten el mapeo a gran escala entre órganos de la distribución de metabolitos sin requerir habilidades de criosecciona de animales enteros altamente especializadas. La cartografía química proporciona evidencia complementaria a los numerosos enfoques transcriptómicos espaciales que se están desarrollando, por ejemplo,44, con la ventaja de centrarse en la “capa ómica más cercana al fenotipo”45. Los métodos alternativos para la cuantificación de la carga de parásitos incluyen la medición de la bioluminiscencia en el momento de la recolección de la muestra6. También se podrían recolectar segmentos finos para permitir que la microscopía confocal o electrónica evalúe la carga de parásitos localizados y el daño tisular. El homogeneizado de agua, que se utiliza para la cuantificación de citoquinas en este protocolo y en publicaciones anteriores13, también podría utilizarse para cuantificar marcadores de daño tisular basados en proteínas.

También hay múltiples formas de obtener modelos 3D adecuados para trazar los datos LC-MS resultantes. Además del método sugerido aquí, los modelos se pueden comprar prefabricados de varios proveedores en línea. Asegúrese de que los términos de uso coincidan con el uso previsto, especialmente en lo que respecta a la publicación. Los modelos para órganos grandes se pueden generar de novo utilizando escáneres 3D de acuerdo con las instrucciones del escáner. Existen alternativas como MATLAB para generar y visualizar modelos 3D para cartografía química46, pero se implementaron principalmente antes del desarrollo de ‘ili16. MATLAB es un conjunto de herramientas de análisis y programación de datos que ofrece una amplia variedad de aplicaciones en muchos campos. Sin embargo, MATLAB no es ni gratuito ni de código abierto, y requiere familiaridad con las interfaces de MATLAB, especialmente teniendo en cuenta que MATLAB no se desarrolló para procesar datos de espectrometría de masas. Las alternativas de este método propuesto, a saber, SketchUp, Meshlab e ‘ili, son de libre acceso, fáciles de usar y ofrecen funciones similares a MATLAB para fines de cartografía química.

Este método es robusto en lo que respecta a la preparación de muestras y la extracción de metabolitos. La solución de problemas suele ser necesaria en el paso de adquisición de datos de LC-MS. Esto está más allá del alcance de este artículo. Los lectores son dirigidos a excelentes publicaciones sobre la solución de problemas de adquisición de datos LC-MS, incluyendo20,47. Del mismo modo, las complejidades de la anotación de metabolitos están más allá del alcance del enfoque de este método en la generación de modelos 3D. Las referencias útiles sobre este tema incluyen24,25,48,49.

Si bien este método explora eficazmente la patogénesis de la enfermedad, existen limitaciones para este enfoque, algunas de las cuales son comunes en cualquier experimento de metabolómica. Una de esas limitaciones es la baja tasa de anotación de las características LC-MS50, que depende de la disponibilidad y calidad de las bibliotecas espectrales de referencia. Otra limitación es que este protocolo no conserva el ARNm debido a la incompatibilidad de los reactivos de preservación de ARN como RNAlater con el análisis LC-MS/MS. Sin embargo, la calidad de la proteína es adecuada para los análisis posteriores y, por lo tanto, puede reemplazar los análisis basados en ARNm.

Un enfoque de cartografía química para la patogénesis de la infección refleja directamente cómo se desarrollan las infecciones bacterianas, virales o parasitarias en los sistemas de órganos y causan enfermedades localizadas. El análisis de estas submuestras regionales y la generación de modelos 3D en última instancia transmite cómo funcionan los metabolitos en todo el espacio tridimensional, arrojando luz sobre estas dimensiones espaciales previamente no reconocidas de la biología molecular. Usando este protocolo, por ejemplo, la localización de metabolitos se comparó con la carga del parásito Trypanosoma cruzi. Los resultados aclararon la relación entre el patógeno y el tejido huésped y también demostraron la dinámica metabólica de la progresión de los síntomas de la enfermedad de Chagas6. Los métodos de cartografía química también se han aplicado a diversos temas, como la interacción del entorno construido por el hombre51,52,53, la composición química de sistemas de órganos como la piel humana46 y los pulmones54, y el metabolismo de las plantas y las interacciones ambientales55. Las aplicaciones futuras pueden implicar la evaluación de la tolerancia y la resiliencia a la enfermedad localizada, o la relación entre los niveles locales de metabolitos, el tropismo del patógeno y el tropismo de la enfermedad en modelos más allá de la infección por tripanosomátidos. Este enfoque también debe tener una amplia aplicabilidad para ampliar los protocolos farmacocinéticos actuales, para evaluar la relación entre los niveles locales de fármacos tisulares y el metabolismo del fármaco frente al contexto metabólico general, el daño tisular y la eliminación de patógenos. En general, la cartografía química permite exploraciones únicas de distribuciones de metabolitos en varios tipos de muestras, con aplicaciones que incluyen patogénesis de enfermedades, salud humana, interacciones entre humanos y medio ambiente y dinámica microbiana.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laura-Isobel McCall, PhD, tiene un Premio de Investigadores en la Patogénesis de Enfermedades Infecciosas del Burroughs Wellcome Fund. Los autores desean además agradecer el apoyo del número de premio de los NIH R21AI148886, una subvención piloto del Centro de Enfermedades Respiratorias e Infecciosas de Oklahoma (OCRID) bajo el número de premio de los NIH P20GM103648, y fondos de puesta en marcha de la Universidad de Oklahoma (a LIM). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los financiadores. Los autores también desean agradecer a los desarrolladores de las herramientas utilizadas en este protocolo. Se han citado todas las publicaciones pertinentes, en su caso.

Materials

1.5 mL Eppendorf tubes NA NA any brand, as available
1 L bottle, pyrex NA NA any brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrex NA NA any brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubes VWR 20901-540 use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) NA NA as appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
96 well plate Fisher 3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balance NA NA any brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
biosafety cabinet NA NA class II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
camera NA NA any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging system NA NA any system, as available
cotton balls NA NA any brand, as available
cryogloves VWR 97008-208 replace with any brand, as available
dissection scissors NA NA any brand, as available
dry ice NA NA any brand, as available
extra-length forceps NA NA any brand, as available
flammable-grade refrigerator NA NA any brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes NA NA any brand, as available
fume hood NA NA any brand, as available
high-resolution mass spectrometer NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucket NA NA any brand, as available
ili software ili.embl.de NA
isoflurane Covetrus 29405
large tupperware NA NA any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrile Fisher Optima A955-4
LC-MS grade dicholoromethane Fisher Optima D151-4
LC-MS grade formic acid Fisher Optima A11750
LC-MS grade methanol Fisher Optima A456-4
LC-MS grade water Fisher Optima W64
liquid chromatography column Phenomenex 00B-4499-AN may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge Phenomenex AJ0-8784 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogen NA NA any brand, as available
luciferin Goldbio LUCK-1G
MeshLab software https://www.meshlab.net/ NA
Meshmixer software https://www.meshmixer.com/ NA
MS calibrant NA NA appropriate one for available instrument
MS data processing software NA NA multiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert software http://proteowizard.sourceforge.net/ NA
Nanodrop ThermoFisher ND-ONE-W other nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettor NA NA any brand, as available
p20 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettor NA NA any brand, as available
p200 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettor NA NA any brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) NA NA any brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) Quansys biosciences 110949MS can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) Zymo D4069 replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocycler NA NA any brand, as available
salt shaker or tea infuser NA NA any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp software https://www.sketchup.com/ NA
specimen forceps NA NA any brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
spreadsheet software https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel NA can replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazine Sigma S9882-100G
sulfadimethoxine Sigma S7007-10G
Sybr green qPCR reaction mix Fisher A25780 can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizer NA NA any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samples NA NA from appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenser Qiagen 69965
UHPLC NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80) NA NA any brand, as available
ultrasonic bath NA NA any system, as available
wet ice NA NA any brand, as available
zone-free sealing film VWR  490007-390
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References

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Dean, D. A., Haffner, J. J., Katemauswa, M., McCall, L. Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection. J. Vis. Exp. (179), e63255, doi:10.3791/63255 (2022).
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