Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida
Summary
Este protocolo descreve os passos para gerar um modelo 3D de distribuição metabólica durante a infecção por triplosomatida, incluindo coleta de amostras, extração metabólica, uma visão geral da aquisição de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem, geração de modelo 3D e, finalmente, visualização de dados.
Abstract
O tropismo patógeno e o tropismo da doença referem-se aos locais de tecido seletivamente colonizados ou danificados por patógenos, levando a sintomas localizados da doença. Os parasitas trypanosomatid humanos incluem Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas; Trypanosoma brucei, o agente causador da doença do sono; e espécies leishmania, agentes causadores da leishmaniose. Em conjunto, afetam 20 milhões de pessoas em todo o mundo. Esses parasitas apresentam tropismo específico: coração, esôfago, cólon para T. cruzi, tecido adiposo, pâncreas, pele, sistema circulatório e sistema nervoso central para T. brucei, pele para cepas dermotropic Leishmania, e fígado, baço e medula óssea para cepas de Leishmania víscero. Uma perspectiva espacial é, portanto, essencial para entender a patogênese da doença trypanosomatida. A cartografia química gera visualizações 3D da abundância de pequenas moléculas geradas através da espectrometria de massa cromatografia líquida, em comparação aos parâmetros microbiológicos e imunológicos. Este protocolo demonstra como a cartografia química pode ser aplicada para estudar processos patogênicos durante a infecção por tripanosomatidas, a partir da amostragem sistemática de tecido e extração metabólica, seguida pela aquisição de dados de espectrometria de massa da cromatografia líquida-tandem, e concluindo com a geração de mapas 3D de distribuição metabólica. Este método pode ser usado para múltiplas questões de pesquisa, como requisitos de nutrientes para colonização tecidual por T. cruzi, T. brucei ou Leishmania, imunometabolismo em locais de infecção, e a relação entre perturbação metabólica do tecido local e sintomas de doenças clínicas, levando a uma visão abrangente da patogênese da doença trypanosomatid.
Introduction
Os parasitas trypanosomatid consistem em espécies de Leishmania, tripanossomos africanos (Trypanosoma brucei) e trypanossoms americanos (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoário causa leishmaniose, que inclui auto-cura e leishmaniose cutânea localizada auto-limitada, leishmaniose mucocutânea na qual os tecidos mucosas da boca, nariz e garganta ficam danificados, e leishmaniose visceral com tropismo parasita aos órgãos viscerais causando febre e hepatosplenomegaly1,2. T. brucei causa tripanosomiase africana humana (HAT), também conhecida como doença do sono, relatada principalmente em países africanos3. Os sinais e sintomas clínicos incluem hepatosplenomegaly, febre, dor de cabeça, dores musculoesqueléticas, linfadenopatias e anemia no estágio hemo-linfático quando os parasitas se localizam na corrente sanguínea e linfáticas. Isso é seguido pelo estágio meningo-encefálico, onde os parasitas se localizam no sistema nervoso central e causam distúrbios do sono, alteração comportamental e, eventualmente, comas4 fatais. T. cruzi causa doença de Chagas, endêmica nas Américas. Indivíduos infectados experimentam um estágio agudo inicial, geralmente assintomático, com tropismo de parasitas amplos. Cerca de 10%-30% dos indivíduos infectados experimentam sintomas crônicos após décadas de infecção, caracterizados por megaófago, megacólon e complicações cardiovasculares5,6.
Metabolômica estuda pequenas espécies moleculares (50-1.500 Da), incluindo compostos biológicos do metabolismo primário ou secundário e compostos derivados externamente, como drogas ou moléculas derivadas de alimentos. No contexto das interações hospedeiro-patógeno, a metabolômica pode explorar o impacto da infecção em ambientes metabólitos hospedeiros, cruciais para acessar o efeito do patógeno no hospedeiro. Também pode avaliar adaptações patógenas ao ambiente nutricional e imunológico hospedeiro7,8,9. Espectrometria de massa (MS) e espectroscopia magnética nuclear (NMR) são ferramentas comuns de metabolômica usadas para identificar, quantificar e caracterizar metabólitos. Essa abordagem “omics” também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao desenvolvimento de medicamentos10,11.
Dado o tropismo tecidual específico dos parasitas trypanosomatid, as análises de metabolômica espacial podem permitir uma visão significativa da patogênese das doenças que causam. O mapeamento da distribuição espacial dos metabólitos revelou metabólitos localmente afetados pela infecção crônica do Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco do rato e infecção aguda e de longo prazo do Trypanosoma cruzi no trato gastrointestinal do camundongo6,12,13. Especificamente, a cartografia química 3D demonstrou uma desconexão entre persistência de parasitas e alterações metabólicas no tecido cardíaco de camundongos cronicamente infectados por Trypanosoma cruzi. O metabolismo foi mais perturbado em segmentos inferiores e apical do coração, combinando com locais de sintomas da doença de Chagas (aneurismas a apical cardíaco). As famílias metabólitos perturbadas pela infecção em locais cardíacos específicos e correlacionadas com a gravidade da doença incluem acircarnitinas e glicerofosforocolinas12,13,14. No trato gastrointestinal, alterações metabólicas persistentes concordaram com locais de sintomas da doença de Chagas: esôfago e cólon. Em contrapartida, o metabolismo é rees normalizado em locais não associados aos sintomas da doença de Chagas, como o intestino delgado. Metabólitos localmente perturbados pela infecção no trato gastrointestinal incluem acicicnitinas, glicerofosforos, kynurenine, triptofano e ácido cholico. Além disso, essas análises permitiram a identificação de um novo mecanismo metabólico de tolerância à doença de Chagas6. A aplicação desses métodos ao estudo da leishmaniose cutânea revelou perturbações metabólicas significativas no local da lesão, mas também alterações metabólicas específicas no tecido adjacente à lesão, macroscopicamente saudável. Por exemplo, a glutamina foi esgotada no local da lesão, enquanto as glicerofosforosforolinas no m/z (proporção massa para carga) 200-299, 400-499, 500-599 e 600-699 foram significativamente aumentadas no local da lesão. O PC (O-34:1) só foi aumentado em locais adjacentes à lesão15.
O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos necessários para gerar modelos 3D de distribuição metabólica (“cartografia química”) aplicadas aos modelos de infecção por parasitas trypanosomatid (Figura 1). Essa abordagem baseia-se em vários avanços críticos no contexto do processamento de dados metabolômicos e metabolômicos, particularmente o desenvolvimento de software ‘ili para traçar dados metabolômicos em modelos 3D facilmente16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entender infecções por tripanosomatidas é essencial para orientar novas abordagens de desenvolvimento e tratamento de medicamentos. Este método de cartografia química está exclusivamente preparado para fornecer insights acionáveis sobre a relação entre o metabolismo e a patogênese da doença trypanosomatida, abordando assim essa necessidade translacional.
Apenas solventes de grau LC-MS são recomendados durante a extração metabólito e análises de MS, para diminuir a contaminação de fundo. A contaminação polimérica35, comumente derivada de filme de parafina e/ou outros plásticos36,37,38, deve ser evitada sempre que possível. O parafilme, em particular, nunca deve ser usado. Esses aspectos são cruciais, uma vez que a qualidade dos dados da LC-MS depende dos materiais utilizados durante a preparação da amostra e a extração metabólica. A qualidade dos dados deve ser garantida antes de gerar ‘ili parcelas. Além disso, a geração desses mapas abrangentes de metabolômica espacial requer a coleta de todas as amostras de tecido adjacentes e extração metabólica de todas as amostras coletadas para evitar lacunas nesses mapas. Os procedimentos de coleta, a logística de extração metabólica e a análise da LC-MS, e os custos devem, portanto, ser considerados e planejados em conformidade.
Este protocolo pode ser modificado para atender às necessidades do usuário de várias maneiras. Por exemplo, a polaridade e solubilidade dos solventes usados durante a extração metabólito influenciará o que os metabólitos são detectados39. Para maximizar a diversidade de características metabólicas detectadas para análises de cartografia química não-diretas, recomenda-se a combinação de múltiplas etapas de extração e solventes. Por exemplo, este método utiliza diclorometano, metanol e água como solventes de extração porque permitem a detecção precisa de moléculas não polares20,40. No entanto, esses solventes não são universalmente adequados para cada experimento de ESM, e os pesquisadores devem selecionar solventes de extração com base nos objetivos de seu projeto. Da mesma forma, podem ser utilizadas diferentes condições de LC-MS/MS, como a substituição da cromatografia de fase inversa por cromatografia de fase normal. Colunas alternativas também podem ser usadas para coleta de dados em fase inversa em vez de cromatografia C8, embora empiricamente, a cromatografia C8 é mais robusta aos lipídios teciduais e tem menor frequência de entupimento. Conceitualmente, esses protocolos também podem ser aplicados a outros métodos de espectrometria de massa, como espectrometria de massa cromatografia gasosa, etc.
Uma abordagem alternativa é a imagem de espectrometria em massa. De fato, ao contrário das abordagens de imagem de espectrometria de massa de massa, a espectrometria de massa cromatografia líquida não preserva inerentemente informações espaciais10. A cartografia química aborda a ponte, incluindo a localização amostral no momento da conceituação do projeto, nos metadados amostrais e nas etapas de processamento de dados. Uma força dessa abordagem de cartografia química, ao contrário da imagem de espectrometria de massa, é a capacidade de fornecer anotações confiantes (Metabolomics Standards Initiative nível 1 ou nível 2 de anotação de confiança41), ao contrário da imagem de espectrometria de massa onde a maior parte das aplicações depende de massa precisa apenas para anotação. A imagem da espectrometria de massa permitirá o mapeamento espacial de grãos finos, às vezes até o nível de célula única, por exemplo, 42,43. Em contraste, as abordagens de cartografia química permitem o mapeamento em larga escala de distribuição de metabólitos sem exigir habilidades altamente especializadas de crioseção animal inteiro. A cartografia química fornece evidências complementares às muitas abordagens transcriômicas espaciais que estão sendo desenvolvidas, por exemplo, 44, com a vantagem de se concentrar na camada ‘omics mais próxima do fenótipo’45. Métodos alternativos para quantificação da carga de parasitas incluem medir a bioluminescência no momento da coleta da amostra6. Segmentos finos também podem ser coletados para permitir microscopia confocal ou eletrônica para avaliar a carga de parasitas localizadas e danos teciduais. A homogeneização da água, que é usada para quantificação de citocinas neste protocolo e publicações anteriores13, também poderia ser usada para quantificar marcadores à base de proteínas de danos teciduais.
Há também várias maneiras de obter modelos 3D adequados para traçar os dados LC-MS resultantes. Além do método sugerido aqui, os modelos podem ser adquiridos pré-fabricados de vários fornecedores online. Certifique-se de que os termos de uso correspondem ao uso pretendido, especialmente no que diz respeito à publicação. Modelos para órgãos grandes podem ser gerados de novo usando scanners 3D de acordo com as instruções do scanner. Alternativas como o MATLAB existem para gerar e visualizar modelos 3D para cartografia química46, mas foram implementadas principalmente antes do desenvolvimento do ili16. O MATLAB é um conjunto de ferramentas de análise e programação de dados que oferece uma grande variedade de aplicações em muitos campos. No entanto, o MATLAB não é gratuito nem de código aberto, e requer familiaridade com as interfaces MATLAB, especialmente considerando que o MATLAB não foi desenvolvido para o processamento de dados de espectrometria em massa. As alternativas deste método proposto, ou seja, SketchUp, Meshlab e ‘ili, são livremente acessíveis, fáceis de usar e oferecem funções semelhantes como MATLAB para fins de cartografia química.
Este método é robusto no que diz respeito à preparação da amostra e à extração metabólica. A solução de problemas é mais frequentemente necessária na etapa de aquisição de dados LC-MS. Isso está além do escopo deste artigo. Os leitores são direcionados para excelentes publicações sobre a solução de problemas de aquisição de dados LC-MS, incluindo 20,47. Da mesma forma, as complexidades da anotação metabólito estão além do escopo do foco deste método na geração de modelos 3D. Referências úteis sobre este tema incluem24,25,48,49.
Embora este método explore efetivamente a patogênese da doença, há limitações para essa abordagem, algumas das quais são comuns em qualquer experimento metabolômico. Uma dessas limitações é a baixa taxa de anotação dos recursos do LC-MS50, que depende da disponibilidade e qualidade das bibliotecas espectrais de referência. Outra limitação é que este protocolo não preserva o mRNA devido à incompatibilidade de reagentes de preservação de RNA, como o RNAlater com a análise LC-MS/MS. No entanto, a qualidade da proteína é adequada para análises a jusante e, portanto, pode substituir análises baseadas em mRNA.
Uma abordagem de cartografia química para a patogênese da infecção reflete diretamente como infecções bacterianas, virais ou parasitárias se desenvolvem em sistemas de órgãos e causam doenças localizadas. Analisar essas subsampleções regionais e gerar modelos 3D finalmente transmite como os metabólitos funcionam através do espaço tridimensional, lançando luz sobre essas dimensões espaciais não reconhecidas anteriormente da biologia molecular. Usando este protocolo, por exemplo, a localização metabólica foi comparada com a carga de parasitas Trypanosoma cruzi. Os resultados esclareceram a relação entre o patógeno e o tecido hospedeiro e também demonstraram a dinâmica metabólica da progressão dos sintomas da doença de Chagas6. Métodos de cartografia química também têm sido aplicados a diversos temas, como a interação ambiente construída pelo homem51,52,53, a composição química de sistemas de órgãos como pele humana46 e pulmões54, e interações de metabolismo e ambiente vegetal55. Aplicações futuras podem envolver a avaliação da tolerância e resiliência localizadas da doença, ou a relação entre os níveis de metabólito local, tropismo patógeno e tropismo de doenças em modelos além da infecção por tripanosomatidas. Esta abordagem também deve ter ampla aplicabilidade para expandir os protocolos atuais de farmacocinética, para avaliar a relação entre os níveis de drogas de tecido local e o metabolismo de drogas versus contexto metabólico geral, danos teciduais e liberação de patógenos. No geral, a cartografia química permite explorações únicas de distribuições metabólitos em vários tipos de amostras, com aplicações incluindo patogênese de doenças, saúde humana, interações ambiente humano e dinâmica microbiana.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laura-Isobel McCall, PhD, é investigadora do Prêmio Patogênese de Doenças Infecciosas do Burroughs Wellcome Fund. Os autores ainda desejam reconhecer o apoio do número de prêmio NIH R21AI148886, uma bolsa piloto do Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) sob o número do prêmio NIH P20GM103648, e fundos de start-up da Universidade de Oklahoma (para LIM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos financiadores. Os autores também desejam agradecer aos desenvolvedores das ferramentas utilizadas neste protocolo. Todas as publicações relevantes foram citadas, quando aplicável.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
References
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