Burada sunulan tüm araştırmalar, Max Planck İnsanlık Tarihi Bilimi Enstitüsü, Jena, Almanya tarafından eski insan kalıntılarıyla çalışmak için belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolün herhangi bir adımını gerçekleştirmeden önce, hem bilimsel çalışma için izin almak hem de bölgenizdeki yıkıcı örnekleme için insan kalıntılarının kullanımı ile ilgili tüm yerel / eyalet / federal etik gerekliliklere uyduğunuzdan emin olun. Tüm prosedürler / kimyasal depolama, bireysel kurumsal güvenlik kurallarına göre yapılmalıdır. 1. Numune işlemeden önce dikkat edilmesi gereken noktalar Eski kalıntılar tekrarlanamaz ve sonlu bir kaynak olduğu için numunelere dikkatle davranın (örneğin; örnekleme mümkün olduğunca az israf edici olmalı ve mümkünse tüm kalıntılar ilgili ve yasal sağlayıcılarına iade edilmelidir). Tüm adımları temiz oda ortamında, tercihen özel bir antik DNA tesisinde gerçekleştirin17,18,19. Kapüşonlu steril mikro gözenekli tulumlar, steril eldivenler (iki çift), cerrahi maske, koruyucu gözlükler ve steril botlar veya steril kapaklı kaymaz ayakkabılardan oluşan kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın (bkz. Eldivenleri, özellikle numuneler arasında sık sık değiştirin. Tüm ekipmanı ve yüzeyleri ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV ışınlaması (dalga boyu: 254 nm) ile mümkün olduğunca iyice temizleyin ve dezenfekte edin (ör. matkap uçları, matkaplar, mengeneler/kelepçeler, vb.). Son olarak, temiz oda ortamı nedeniyle aşırı yorgunluğu önlemek için düzenli ergonomik molalar (mümkünse her 2-3 saatte bir) almanız şiddetle tavsiye edilir.NOT: Tüm iskelet kalıntıları örneklemeden önce uygun şekilde belgelenmelidir (örneğin, fotoğraflanmış, tartılmış ve mümkünse mikro-BT taramalı, 3D görüntülü, vb.) (uygun dokümantasyon protokolleri bu makalede ele alınmamıştır). Tüm örnekleme protokolleri örnekleme yinelemeleri arasında duraklatılabilir ve numuneler kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C), steril bir ortamda süresiz olarak saklanabilir. 2. Ön işlem Kontaminasyon riskini en aza indirmek için kemik tozu oluşturmadan önce tüm anatomik numune alma yerlerini dekontamine edin18.NOT: Numune dekontaminasyonu için ağartıcının ve/veya yüzey gideriminin etkinliği (yüzey kaldırma adımları için adım 3.3.2’deki NOT’a bakınız) aDNA araştırmacıları arasında hala bir tartışma konusudur 8,19,20,21,22,23,24,25 çünkü her ikisi de genel DNA verimini, özellikle de yüksek oranda bozulmuş numunelerde etkileyebilir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar isteğe bağlı olarak kabul edilir ve bu makalede sunulan temsili sonuçları oluşturmak için tüm örneklerde kullanıldığı için buraya dahil edilmiştir. Bu ön tedavi protokollerinin kullanımının, her bir numune setinin moleküler uygulamasına, yaşına, nadirliğine ve morfolojik bozunma seviyesine bağlı olarak duruma göre belirlenmesi önerilir.Tüm numune alımlarını, UV ışığı ile donatılmış polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) davlumbaz veya hava akışı kapalı biyogüvenlik kabini altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyoyu atmadan önce tüm kemik parçalarının geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her iskelet elemanının tedavisi arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın. Alanı tüy bırakmayan kuru steril bir mendille nazikçe silerek anatomik örnekleme yerlerinden mümkün olduğunca fazla gevşek kir/detritusu temizleyin (bkz. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın. Temizlenen yüzeyi, seyreltilmiş ticari ağartıcı ile nemlendirilmiş steril bir mendille silerek dekontamine edin (~% 0.01 v / v, ultra saf DNaz / RNaz içermeyen su ile seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca inkübe etmeye bırakın. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın.DİKKAT: Ağartıcı oldukça aşındırıcı ve reaktif bir kimyasaldır; bu nedenle kullanımdan önce uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. Ultra saf DNase/RNase içermeyen suyla nemlendirilmiş steril bir mendil ile anatomik örnekleme yerinden mümkün olduğunca fazla artık ağartıcıyı temizleyin. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın. Temizlenmiş tüm anatomik numune alma yerlerini 30 dakika boyunca UV radyasyonuna maruz bırakın (dalga boyu: 254 nm) ve ardından oda sıcaklığında tamamen kurumaya bırakın. Sadece kemik tozu oluşumunu kolaylaştırmak için değil, aynı zamanda numunenin daha fazla bozulmasını önlemek için numuneye almadan veya depolamaya geri dönmeden önce anatomik numune alma yerlerinin tamamen kuru olduğundan emin olun (örneğin, küf).DİKKAT: UV radyasyonuna maruz kalmak gözlere zararlı olabilir. Hemen numune almaya geçin veya iskelet elemanlarını kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın. 3. Kemik tozu üretimi NOT: Aşağıdaki protokoller, Dabney et al. 2019 protokol26’yı takiben DNA ekstraksiyonunda kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Örnekleme pars petrosaNOT: Bu protokol, Pinhasi et al. 2019’da açıklanan prosedürlerden uyarlanmıştır.4 ve kullanım kolaylığı için burada sunulmaktadır. Bu protokol, örnekleme için güncel, en az yıkıcı yöntemi temsil etmemektedir. pars petrosa. Bu nedenle, Sirak ve ark. 2017 tarafından açıklanan protokolün kullanılması önerilir.13 veya Orfanou ve ark. 202014 morfolojik korumanın maksimum öneme sahip olduğu örnekler için.Tüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyoyu atmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/kabına atın. Kuru, dekontamine olmuş elemanı sterilize edilmiş bir kelepçe veya mengene kullanarak sabitleyin. Aşırı ısınmayı önlemek için pars petrosa’yı üstün sulkus petrosus boyunca ikiye bölün (bkz. Şekil 1), 0,6 mm’lik bir bıçakla donatılmış standart bir kuyumcu testeresi kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu) orta hızda (bkz. adım 3.1.6’nın altındaki NOT).DİKKAT: Pars petrosa çok yoğundur ve bu nedenle kesilmesi zor olabilir. Yaralanmayı önlemek için elemanı güvenli bir şekilde kelepçeli tutmaya özen gösterin. Kırık testere bıçaklarını uygun kesici uçların kabına atın. Petrus kısımlarını kelepçeden çıkarın. Gevşek / fazla malzemeyi kurtarın ve kaydedin. Tartım kağıdını steril bir tartım teknesine yerleştirin Petrus kısmını tartım kağıdının üzerinde tutun, tarafı tartım tepsisine doğru eğerek kesin. Küçük bir gösterge ucu ile donatılmış diş matkabını kullanarak yüz kanalı ile mastoid antrum arasındaki yoğun kortikal kemiğe delin (çevreleyen malzemeden daha parlak görünür, bkz. Şekil 1) ve kemik tozu üretmek için orta hıza, orta torka ayarlayın.NOT: Delme/Kesme, kemiğin aşırı ısınmasını ve potansiyel olarak DNA’yı tahrip etmeyi/zarar vermesini önlemek için düşük ila orta hızlarda kısa patlamalarla yapılmalıdır. Anekdotsal olarak, petrozun yoğun kısmı aşırı ısınmaya başladığında, pastırma pişirme pastırması olarak tanımlanan bir koku gözlenebilir. Delmeyi/testereyi derhal durdurun ve devam etmeden önce kemiğin yeterince soğuyana kadar dinlenmesini sağlayın. Tartım kağıdında yaklaşık 50-100 mg toz toplanana kadar sondaj işlemini tekrarlayın ve en az 0,01 mg’a kadar hassas kapalı bir terazi kullanılarak ölçülür (bkz.NOT: Mümkün olduğunda, her biri 50 mg’lık iki replika DNA ekstraksiyonuna izin vermek için 100 mg kemik tozu toplanması önerilir. Bununla birlikte, anatomik örnekleme yerlerinin kendilerinin sınırlandırılması (örneğin, distal falanks, diş pulpası odası) veya morfolojik koruma ihtiyacı nedeniyle bu her zaman mümkün olmayabilir. Sementum gibi diğer yerler için, 50 mg’dan daha az malzeme mevcut olabilir. Bununla birlikte, sementum, diş pulpası odası ve distal falanksın hepsinin, ekstraksiyon işleminden kemik tozunun daha düşük ilk girişine rağmen, önemli endojen DNA11,27,28 verdiği gösterilmiştir. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon veya depolama için 2 mL etiketli, düşük ciltli, emniyetli kilitli bir tüpe aktarın. Numuneleri süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kalan kemik/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler, vb.) ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak sterilize edin/dekontamine edin. Resim 1: Pars petrosa dahil temporal kemik. (A) Petrus piramidinin ve sulkus petrosasının yerlerini gösteren numune ön kesimi. (B) Delinecek yoğun alanları vurgulayan kesim sonrası Petrous kısmı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kalıcı azı dişlerinin örneklenmesiNOT: Kalıcı azı dişlerinin örneklemesi için, önceden seçim yapın in situ kaynaşmış kökleri olan ve ideal olarak çürüklerden, emayedeki çatlaklardan veya en iyi sonuçlar için aşırı aşınmadan arındırılmış azı dişleri. Herhangi bir diş taşı örneklemesini çıkarın ve oral mikrobiyomun gelecekteki olası analizleri için -20 ° C’de saklayın (prosedür burada ele alınmamıştır).Sementumun örneklenmesiTüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın. Steril bir tartım tepsisine bir tartım kağıdı yerleştirin. Dekontamine olmuş azı dişini, ayarlanabilir anahtar gibi elde tutulan bir kelepçe kullanarak emaye ile bir tartım tepsisinin üzerinde tutun/sabitleyin (bkz. Bir diş matkabını elmas kenarlı dairesel bir kesme tekerleği ile donatın. Matkap orta hız/tork ayarına ayarlandığında, ucun kenarını yaklaşık -20°’lik bir açıyla köke hafifçe vurun. Sarı, en dıştaki malzemeyi kökten (çimento) çıkarmak / toplamak için tepsiye aşağı doğru kazıyın. Dentinin daha hafif (beyaz) materyali görünür hale geldiğinde toplamayı durdurun.NOT: Tozun aerosol haline gelmesini ve tepsiyi tamamen kaçırarak numuneyi potansiyel olarak boşa harcamasını önlemek için kesme ucunun toplama tepsisine göre dönme yönünü eşleştirmek önemlidir. Sementum özellikle DNA bakımından zengindir; Bununla birlikte, tipik malzeme verimleri diğer anatomik örnekleme yerlerinden (~ 7-20 mg) 11,27,28’den çok daha küçüktür. Tartım kağıdında toplanan toz kütlesini, en az 0,01 mg’a kadar hassasiyete sahip kapalı bir terazi kullanarak kaydedin (bkz. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik alçak bağlantılı, emniyetli bir kilit tüpüne aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kağıt hamuru odasından numune almaSementum toplandıktan sonra (istenirse), tacı çıkarmak için bir kuyumcu testeresi kullanarak azı dişini semento-emaye kavşağı boyunca kesitleyin (bkz. Şekil 2). Yeni bir tartım tepsisine yeni bir tartım kağıdı yerleştirin. Kurma kolu bölümünü, tartım tepsisinin üzerine elde taşınan bir kelepçe veya mengene ile sabitleyin. Kesme tarafını aşağı doğru eğilmiş tutun ve taç kısmı içindeki kağıt hamuru haznesinin kenarları boyunca küçük bir gösterge delme ucu (bkz. Malzeme Tablosu) ile donatılmış bir dental matkapla ilk geçiş olarak malzemeyi delin/kazıyın (bkz. Şekil 2).NOT: Pulpa odasının iç kısmının sadece ilk geçişi toplanmalı ve pulpa malzemesi olarak etiketlenmelidir (5-15 mg tipik verim), dişin derinliklerindeki herhangi bir şey dentin olarak kabul edilir. Dişi, alt kısmı aşağı bakacak şekilde çevirin, kelepçeye çekiçle dokunun ve tartım kağıdındaki serbest bırakılmış tozu toplayın. Tartım kağıdında toplanan tozun ağırlığını, en az 0,01 mg’a kadar hassasiyete sahip kapalı bir terazi kullanarak kaydedin (bkz. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL düşük ciltli, emniyetli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Dentin örneklemesiYeni bir tartım tepsisine yeni bir tartım kağıdı yerleştirin. Taç bölümünü tartım tepsisinin üzerinde tutun (3.2.2.3. adıma göre), daha fazla dentin örneklemesi için pulpa haznesinin iç kısmından 0,01 mg’a kadar hassas kapalı bir terazi kullanılarak ölçülen 50-100 mg dentini delin ve toplayın (bkz. Şekil 2). Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik düşük bağlantılı, güvenli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kalan diş parçalarını/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her numune alma işlemi arasında uygun olduğu şekilde ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetlerini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin. Şekil 2: Kalıcı azı dişi ön örneklemesi . (A) Örneklemeden önce önceden işlenmiş azı dişi, taç, sementum (kökün sarımsı tabakası) ve semento-emaye kavşağındaki kesme bölgesini gösterir. (B) Semento-emaye kavşağındaki kesim bölgesini gösteren aynı azı dişi post-sementum koleksiyonu. (C) Diş pulpası odası ve taç içindeki dentin için anatomik örnekleme yerlerini gösteren molar kesim sonrası ve örnekleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Torasik vertebra örneklemesiVertebral cismin örneklenmesiTüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Omurları, omur gövdesi dışa doğru olacak şekilde bir kelepçe veya el mengene ile sabitleyin. Omurları, omur gövdesi aşağı doğru eğilmiş olarak tartım tepsisinin üzerinde tutun. Düşük hızlı yüksek torka ayarlanmış küçük bir gösterge delme ucu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile donatılmış bir dental matkap kullanarak, vertebral gövdenin cancellous iç dokusunu çevreleyen kortikal kemiğin en dış kenarı (alt ve üstün) boyunca delin (bkz. Şekil 3). 0,01 mg’a kadar hassas bir kapalı terazi kullanılarak ölçülen 50-100 mg malzeme toplanana kadar biti standart bir ağırlık tepsisi üzerinde kortikal tabakaya karşı kazıyın (bkz. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik düşük bağlantılı, güvenli bir kilit tüpüne aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Superior vertebral arkın örneklenmesiNOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Üstün vertebral kemerin kortikal kemiğinin en dış tabakasını, yüzey19 boyunca kazıyarak küçük bir delme ucu ile donatılmış bir diş matkabı kullanarak çıkarın ve atın (bkz. Bu, vertebral gövdeden örnekleme için önerilmez, çünkü kortikal kemik tabakası genellikle çok incedir ve bu işlemle tamamen tükenmesi muhtemeldir (bkz. bölüm 2’deki NOT).Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Omurları, vertebral süreç dışa doğru, üstün yönü aşağı doğru olan bir el kelepçesi / mengene ile sabitleyin. Omurları tutarken, üstün yönü aşağıda, bir tartım tepsisi üzerinde, dikenli işlemin lameller ile füzyonu ile oluşturulan V şeklindeki çentiğin ortasına doğru yukarı doğru delin (bkz. Şekil 3), düşük hıza ve yüksek torka ayarlanmış küçük bir gösterge ucuna sahip bir diş matkabı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu). Dirençte gözle görülür bir düşüş olduğunda sondajı durdurun. Delme pozisyonunu hafifçe değiştirin ve 0,01 mg’a kadar hassas bir kapalı terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar tekrarlayın (bkz. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kalan kemik/fazla tozu kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda iade/geri dönüşe kadar saklayın. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her bir numune alma arasında ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin. Şekil 3: Torasik omurların vertebral gövdesi ve superior vertebral arch kortikal kemik anatomik örnekleme yerleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Distal falanks örneklemesiNOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Şaftın ve/veya apikal tutamın kortikal kemiğinin en dış tabakasını, yüzey19 boyunca kazıyarak küçük bir mastar delme ucu ile donatılmış bir diş matkabı kullanarak çıkarın ve atın. Bu, aşırı ince kortikal kemik veya çocuk kalıntıları olan numuneler için mümkün olmayabilir (bkz. bölüm 2’deki NOT).Tüm numune alımlarını özel bir temiz odada, UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (UV dalga boyu: 254 nm) altında, hava akışı kapalıyken gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Numuneyi el tipi kelepçe/mengene ile sabitleyin, üst tarafı yukarı doğru. Numuneyi tartım tepsisinin üzerinde tutun, küçük bir gösterge delme ucuyla donatılmış bir diş matkabı kullanarak en dıştaki yoğun katmanları delerek (bkz. Şekil 4) apikal kemiğin alt tarafındaki kortikal kemikten kemik tozu toplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Dirençte belirgin bir azalma olduğunda sondajı durdurun, çünkü bu daha hafif, iptal edici malzeme anlamına gelir. İlk sondajdan dışarıya doğru yayılan bu işlemi tekrarlayın, en az 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar, 0,01 mg’a kadar doğru kapalı bir terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi (bkz. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik düşük bağlantılı, güvenli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kalan kemik/fazla tozu kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda, geri dönüşe/geri dönüşe kadar saklayın. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her bir numune alma arasında uygun olduğu şekilde ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV ışınlarına maruz kalma özelliklerini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin.NOT: Daha küçük numuneler için (örneğin, genç numuneler), numune için önerilen 50-100 mg kortikal kemikten çok daha az olabilir. Bununla birlikte, düşük miktarlarda bile, bu anatomik örnekleme yerinin DNA11 açısından özellikle zengin olduğu gösterilmiştir. Şekil 4: Yoğun kortikal kemiğin şaft boyunca ve apikal tutamın inferior tarafındaki yerlerini gösteren distal falanks. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Talus’un örneklenmesiTüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin. Numuneyi el tipi kelepçe/mengene ile sabitleyin, kubbe yukarı doğru yerleştirin. Talus’u, kubbeyi yukarı ve medial yüzeyi toplayıcıya doğru, tartım tepsisinin üzerinde tutun. Düşük hız ve yüksek torka ayarlanmış düşük gösterge ucuna sahip bir diş matkabı kullanarak kortikal kemiği talusun boynundan ~1 mm derinliğe kadar kazıyın (bkz. Şekil 5). Delme pozisyonunu hafifçe değiştirin ve 0,01 mg’a kadar doğru kapalı bir terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi yaklaşık 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar tekrarlayın (bkz. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL’lik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C’de saklayın. Kalan kemik/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler, vb.) ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak sterilize edin/dekontamine edin. Şekil 5: Kortikal kemik geri kazanımı için talusun örnekleme alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Talus çok az kortikal kemiğe sahiptir (ince bir dış tabaka). Malzeme sadece yüzeyden değil, aynı zamanda altta yatan yoğun cancellous kemik tabakasından da toplanmalıdır.