يقدم البروتوكول سلسلة من بروتوكولات أفضل الممارسات لجمع مسحوق العظام من ثمانية مواقع أخذ عينات تشريحية موصى بها (مواقع محددة على عنصر هيكلي معين) عبر خمسة عناصر هيكلية مختلفة من أفراد العصور الوسطى (الكربون المشع يرجع تاريخه إلى فترة حوالي 1040-1400 م ، معايرة نطاق 2 سيجما).
تسعى الطرق المقدمة هنا إلى تعظيم فرص استعادة الحمض النووي البشري من البقايا الأثرية القديمة مع الحد من مواد عينة الإدخال. تم ذلك عن طريق استهداف مواقع أخذ العينات التشريحية التي تم تحديدها مسبقا لإنتاج أعلى كميات من الحمض النووي القديم (aDNA) في تحليل مقارن لاستعادة الحمض النووي عبر الهيكل العظمي. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن هذه البروتوكولات تزيد من فرص التعافي الناجح للحمض النووي البشري القديم والممرض من البقايا الأثرية. تم تقييم غلة الحمض النووي سابقا بواسطة Parker et al. 2020 في مسح واسع للحفاظ على الحمض النووي عبر عناصر هيكلية متعددة من 11 فردا تم استردادهم من مقبرة العصور الوسطى (الكربون المشع مؤرخة في فترة حوالي (حوالي 1040-1400 م ، معايرة نطاق 2 سيجما) في كراكور بيرج ، وهي مستوطنة مهجورة من العصور الوسطى بالقرب من Peißen ألمانيا. نجحت نقاط أخذ العينات الثمانية هذه ، والتي تمتد على خمسة عناصر هيكلية (pars petrosa ، والأضراس الدائمة ، والفقرة الصدرية ، والكتائب البعيدة ، والكاحل) في إنتاج الحمض النووي البشري القديم عالي الجودة ، حيث كانت الغلة أكبر بكثير من المتوسط العام عبر جميع العناصر والأفراد. كانت الغلة كافية للاستخدام في معظم التحليلات الجينية الشائعة للسكان في المصب. تدعم نتائجنا الاستخدام التفضيلي لمواقع أخذ العينات التشريحية هذه لمعظم الدراسات التي تتضمن تحليلات الحمض النووي البشري القديم من البقايا الأثرية. سيساعد تنفيذ هذه الأساليب على تقليل تدمير العينات الأثرية الثمينة.
إن أخذ عينات من الرفات البشرية القديمة لأغراض استعادة الحمض النووي وتحليله مدمر بطبيعته1،2،3،4. العينات نفسها هي عينات ثمينة ويجب الحفاظ على الحفظ المورفولوجي حيثما أمكن ذلك. وعلى هذا النحو، من الضروري تحسين ممارسات أخذ العينات لتجنب التدمير غير الضروري للمواد التي لا يمكن تعويضها ولزيادة احتمال النجاح إلى أقصى حد. تستند تقنيات أفضل الممارسات الحالية إلى مجموعة صغيرة من الدراسات التي تقتصر إما على مسوحات الطب الشرعي5،6 ، أو دراسات العينات القديمة حيث لا يكون تطوير أخذ العينات الأمثل هو الهدف المباشر للدراسة7 ، أو الدراسات المخصصة التي تستخدم إما بقايا غير بشرية8 أو تستهدف مجموعة صغيرة جدا من مواقع أخذ العينات التشريحية (تستخدم هنا للدلالة على منطقة معينة من عنصر الهيكل العظمي الذي مسحوق العظام منه ، للاستخدام في تحليلات الحمض النووي النهائية ، تم إنشاؤه)9,10. تم تحسين بروتوكولات أخذ العينات المعروضة هنا في أول دراسة منهجية واسعة النطاق لحفظ الحمض النووي عبر عناصر هيكلية متعددة من أفرادمتعددين 11. جميع العينات ناتجة عن عناصر هيكلية تم استردادها من 11 فردا تم التنقيب عنهم من مقبرة الكنيسة في مستوطنة كراكور بيرغ المهجورة التي تعود إلى العصور الوسطى بالقرب من بيسن ، ساكسونيا أنهالت ، ألمانيا (انظر الجدول 1 للحصول على التركيبة السكانية التفصيلية للعينات) ، وعلى هذا النحو ، قد تحتاج إلى تعديل لاستخدامها مع عينات خارج هذا النطاق الجغرافي / الزمني.
فرد | جنس | العمر المقدر عند الوفاة | 14 تواريخ C (CE ، Cal 2-sigma) |
كرا 001 | ذكر | 25-35 | 1058-1219 |
كرا 002 | أنثى | 20-22 | 1227-1283 |
كرا003 | ذكر | 25 | 1059-1223 |
كرا004 | ذكر | 15 | 1284-1392 |
كرا 005 | ذكر | 10-12 | 1170-1258 |
كرا 006 | أنثى | 30-40 | 1218-1266 |
كرا 007 | أنثى | 25-30 | 1167-1251 |
كرا008 | ذكر | 20 | 1301-1402 |
كرا 009 | ذكر | مجهول | 1158-1254 |
كرا 010 | ذكر | 25 | 1276-1383 |
كرا 011 | أنثى | 30-45 | 1040-1159 |
الجدول 1: الجنس المحدد وراثيا ، والعمر المقدر المحدد أثريا عند الوفاة ، والتأريخ بالكربون المشع (14C Cal 2-sigma) لجميع الأفراد ال 11 الذين تم أخذ عينات منهم. تم تكييف هذا الجدول من Parker، C. et al. 202011.
تسمح هذه البروتوكولات بتوليد مسحوق العظام بشكل مباشر وفعال نسبيا من ثمانية مواقع لأخذ العينات التشريحية عبر خمسة عناصر هيكلية (بما في ذلك pars petrosa) مع تلوث محدود للحمض النووي الناجم عن المختبر. من بين هذه العناصر الهيكلية الخمسة ، تم تحديد سبعة مواقع لأخذ العينات التشريحية الموجودة على أربعة عناصر هيكلية لتكون بدائل قابلة للتطبيق لأخذ العينات المدمرة للهرم الصخري11,12. وتشمل هذه الملاط ، العاج ، وغرفة اللب من الأضراس الدائمة. العظم القشري الذي تم جمعه من الشق الفقري العلوي وكذلك من جسم الفقرات الصدرية ؛ العظم القشري النابع من السطح السفلي للخصل القمي وعمود الكتائب البعيدة ؛ والعظم القشري الكثيف على طول الجزء الخارجي من تالي. في حين أن هناك العديد من الطرق المطبقة على نطاق واسع لأخذ عينات من pars petrosa4،12،13،14 ، العاج ، وغرفة لب الأسنان1،2،15 ، فإن الطرق المنشورة تصف الجيل الناجح لمسحوق العظام من الملاط 16 ، والجسم الفقري ، والشق الفقري السفلي ، والكاحل قد يكون من الصعب الحصول عليها. على هذا النحو ، نوضح هنا بروتوكولات أخذ العينات المحسنة للهرم الصخري (الخطوة 3.1) ؛ الملاط (الخطوة 3.2.1) ، العاج (الخطوة 3.2.2) ، ولب الأسنان (الخطوة 3.2.3) من الأضراس البالغة ؛ العظم القشري للجسم الفقري (الخطوة 3.3.1) والقوس الفقري العلوي (الخطوة 3.3.2) ؛ الكتائب البعيدة (الخطوة 3.4) ؛ والكاحل (الخطوة 3.5) من أجل جعل الاستخدام الفعال لهذه العناصر الهيكلية لكل من الحمض النووي وأبحاث الطب الشرعي متاحا على نطاق أوسع.
الممارسة الحالية في علم الوراثة البشرية القديمة هي أخذ عينات تفضيلية من pars petrosa (الخطوة 2.1) كلما أمكن ذلك. ومع ذلك ، يمكن أن يكون pars petrosa عينة يصعب الحصول عليها ، حيث أنها ذات قيمة عالية لعدد لا يحصى من تقييمات الهيكل العظمي (على سبيل المثال ، تاريخ السكان32 ، وتقدير عمر الجنين عند الوفاة 33 ، وتحديد الجنس34) ، وتاريخيا ، يمكن أن يكون أخذ عينات من pars petrosa لتحليل الحمض النووي مدمرا للغاية 3,4 (بما في ذلك البروتوكول المقدم هنا ، على الرغم من أن البروتوكولات الجديدة طفيفة التوغل13,14 قد تم اعتمادها الآن على نطاق واسع للتخفيف من هذا القلق). ويضاف إلى ذلك حقيقة أنه حتى وقت قريب جدا ، لم تتم محاولة إجراء دراسة منهجية واسعة النطاق لاستعادة الحمض النووي البشري عبر الهيكل العظمي11 ، مما يجعل العثور على استراتيجية مناسبة لأخذ العينات عندما يكون الهرم الصخري غير متاح أمرا صعبا.
تساعد البروتوكولات المقدمة هنا على التخفيف من هذا التحدي من خلال توفير مجموعة من الإجراءات المثلى لأخذ عينات الحمض النووي من بقايا الهيكل العظمي الأثري / الشرعي بما في ذلك pars petrosa بالإضافة إلى سبعة مواقع بديلة لأخذ العينات التشريحية عبر أربعة عناصر هيكلية إضافية. وتهدف جميع الخطوات الحاسمة المدرجة إلى التقليل إلى أدنى حد من احتمال فقدان/تلف الحمض النووي إما بسبب عدم كفاءة أخذ العينات (الخطوتان 2-1-6 و3-2-1-3) أو ارتفاع درجة حرارة العينات أثناء الحفر/القطع (الخطوة 3-1-6). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ في جميع أنحاء البروتوكول أنه قد يكون من الضروري تعديل / حذف خطوات ما قبل المعالجة لضمان أفضل أداء في العينات شديدة التدهور. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه حتى من بين العناصر المختارة المعروضة هنا ، لا تزال هناك العديد من تقنيات أخذ العينات البديلة الممكنة (خاصة بالنسبة ل pars petrosa13,14) ، بالإضافة إلى مجال واسع لمزيد من تحسين مواقع أخذ العينات التشريحية غير المستغلة المعروضة هنا (أي talus: الخطوة 2.5 والفقرات: الخطوة 2.3).
من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن هذه البروتوكولات قد تم تصميمها واختبارها باستخدام بقايا قديمة من الأحداث البالغين ذات جودة عالية (حفظ مورفولوجي جيد) لأغراض تحليلات الحمض النووي البشري الداخلي. قد لا تمتد النتائج المقدمة إلى المواد المتدهورة للغاية ، أو سياقات الحفظ الأخرى ، أو رفات الرضع ، أو الرفات غير البشرية ، أو دراسات مسببات الأمراض أو الميكروبيوم ، حيث لا تزال هناك حاجة إلى استكشاف أكبر لاستخدام هذه البروتوكولات في سياقات إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب تعيين العناصر الهيكلية البديلة المعروضة هنا (الأسنان والفقرات والكتائب البعيدة والتالي) لفرد واحد بين البقايا المختلطة ، مما يستلزم أخذ عينات من عناصر متعددة لضمان أصل واحد. على الرغم من هذه القيود ، فإن إتاحة هذه البروتوكولات على نطاق واسع يمكن أن يساعد في التخفيف من بعض عدم التجانس المحيط باختيار العينات ومعالجتها من خلال توفير إطار عام ومحسن كميا للاستخدام في مجموعة واسعة من دراسات الحمض النووي / الطب الشرعي المستقبلية على الرفات البشرية.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا موظفي المختبر في معهد ماكس بلانك لعلوم التاريخ البشري على مساعدتهم في تطوير وتنفيذ هذه البروتوكولات. لم يكن هذا العمل ممكنا بدون المدخلات والعمل الجاد للدكتور جويدو براندت والدكتورة إليزابيث نيلسون وأنتجي ويسيغوت وفرانزيسكا آرون. تم تمويل هذه الدراسة من قبل جمعية ماكس بلانك ، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقيات المنح رقم 771234 – PALEoRIDER (WH، ABR) ومنحة البدء رقم 805268 CoDisEASe (إلى KIB).
#16 Dental Drill Bit | NTI | H1-016-HP | example drilling bit |
0.6 mm scroll saw blade | Fisher Scientific | 50-949-097 | blade for Jewellers Saw |
22mm diamond cutting wheel | Kahla | SKU 806 104 358 514 220 | Dremel cutting attachment |
Commercial Bleach | Fisher Scientific | NC1818018 | |
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil | Fisher Scientific | 15-078-29X | |
DNA LoBind Tubes (2 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment | Dremel | 225-01 | Dremel flexible extension |
Dremel 4300 Rotary Tool | Dremel | 4300 | Example drill |
Dremel collet and nut kit | Dremel | 4485 | Adapters for various Dremel tool attachments/bits |
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag | Fisher Scientific | 17-988-501 | |
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 13-698-792 | |
Ethanol (Molecular Biology Grade) | Millipore Sigma | 1.08543 | |
FDA approved level 2 Surgical Mask | Fisher Scientific | 50-206-0397 | PPE |
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-041-171X | PPE |
Fisherbrand Safety Glasses | Fisher Scientific | 19-130-208X | PPE |
Granger Stationary Vise | Fisher Scientific | NC1336173 | benchtop vise |
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
Jewellers Saw | Fisher Scientific | 50-949-231 | |
Kimwipes | Sigma-Aldritch | Z188956 | |
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet | Fisher Scientific | 30-368-1101 | |
LookOut DNA Erase | Millipore Sigma | L9042-1L | |
Medium weighing boat | Heathrow Scientific | HS120223 | |
MSC 10pc plier/clamp set | Fisher Scientific | 50-129-5352 | Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting |
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 14-560-019 | enclosed balance |
Tyvek coveralls with hood | Fisher Scientific | 01-361-7X | PPE |
Weigh paper | Heathrow Scientific | HS120116 |