Protocolli di campionamento osseo ottimizzati per il recupero di DNA antico da resti archeologici

Tutte le ricerche qui presentate sono state eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Max Planck Institute for the Science of Human History, Jena, Germania per lavorare con antichi resti umani. Prima di eseguire qualsiasi passaggio di questo protocollo, assicurati di aderire a tutti i requisiti etici locali / statali / federali relativi sia all’ottenimento del permesso per lo studio scientifico che all’uso di resti umani per il campionamento distruttivo nella tua zona. Tutte le procedure/stoccaggio chimico devono essere eseguite secondo le singole linee guida istituzionali di sicurezza. 1. Considerazioni prima dell’elaborazione del campione Trattare i campioni con cura poiché i resti antichi sono una risorsa irreplicabile e finita (ad esempio, il campionamento dovrebbe essere il meno dispendioso possibile e tutti i resti restituiti ai rispettivi e legittimi fornitori, se possibile). Eseguire tutti i passaggi in un ambiente di camera bianca, preferibilmente in una struttura dedicata al DNA antico17,18,19. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) costituiti da tute sterili microporose con cappuccio, guanti sterili (due paia), maschera chirurgica, occhiali protettivi e stivali sterili o scarpe antiscivolo con coperture sterili (vedere Tabella dei materiali). Cambiare frequentemente i guanti, soprattutto tra un campione e l’altro. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le apparecchiature e le superfici con candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo e irradiazione UV (lunghezza d’onda: 254 nm) ove possibile (ad esempio, punte da trapano, trapani, morse/morsetti, ecc.). Infine, si consiglia vivamente di fare pause ergonomiche regolari (ogni 2-3 ore se possibile) per evitare l’eccessivo esaurimento dovuto all’ambiente della camera bianca.NOTA: Tutti i resti scheletrici devono essere adeguatamente documentati (ad esempio, fotografati, pesati e, se possibile, scansionati con micro-CT, immagini 3D, ecc.) prima del campionamento (i protocolli per la documentazione appropriata non sono trattati in questo manoscritto). Tutti i protocolli di campionamento possono essere sospesi tra le iterazioni di campionamento e i campioni possono essere conservati indefinitamente in un ambiente asciutto, a temperatura controllata (25 °C), sterile. 2. Pretrattamento Decontaminare tutte le posizioni di campionamento anatomico prima della generazione di polvere ossea per ridurre al minimo il rischio di contaminazione18.NOTA: L’efficacia della candeggina e/o della rimozione superficiale (vedere NOTA al punto 3.3.2 per le fasi di rimozione delle superfici) per la decontaminazione del campione è ancora oggetto di dibattito tra i ricercatori di aDNA 8,19,20,21,22,23,24,25 poiché entrambi possono influenzare le rese complessive del DNA, specialmente in campioni altamente degradati. Pertanto, i seguenti passaggi sono considerati facoltativi e sono inclusi qui poiché sono stati utilizzati in tutti gli esempi per generare i risultati rappresentativi presentati in questo documento. Si raccomanda di determinare caso per caso l’uso di questi protocolli di pretrattamento in base all’applicazione molecolare, all’età, alla rarità e al livello di degradazione morfologica di ciascun set di campioni.Eseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata sotto una cappa di reazione a catena della polimerasi (PCR) dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza con flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire il foglio. Cambia la pellicola tra il trattamento di ciascun elemento scheletrico. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Rimuovere quanto più sporco/detrito sciolto possibile dalle posizioni di campionamento anatomico strofinando delicatamente l’area con una salvietta sterile asciutta priva di lanugine (vedere Tabella dei materiali). Smaltire le salviette in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Decontaminare la superficie pulita strofinando con una salvietta sterile inumidita con candeggina commerciale diluita (~0,01% v/v, diluita con acqua ultrapura priva di DNasi/RNasi) e lasciare incubare per 5 minuti. Smaltire le salviette in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico.ATTENZIONE: La candeggina è una sostanza chimica altamente corrosiva e reattiva; Pertanto devono essere prese adeguate precauzioni di sicurezza prima del suo uso. Rimuovere quanta più candeggina residua possibile dalla posizione di campionamento anatomico con una salvietta sterile inumidita con acqua ultrapura priva di DNasi/RNasi. Smaltire le salviette in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Esporre tutte le posizioni di campionamento anatomico pulite alle radiazioni UV per 30 minuti (lunghezza d’onda: 254 nm), quindi lasciare asciugare completamente a temperatura ambiente. Assicurarsi che le posizioni di campionamento anatomico siano completamente asciutte prima di procedere con il campionamento o tornare allo stoccaggio non solo per facilitare la generazione di polvere ossea, ma anche per prevenire un’ulteriore degradazione del campione (ad esempio, muffa).ATTENZIONE: L’esposizione alle radiazioni UV può essere dannosa per gli occhi. Passare immediatamente al campionamento o conservare gli elementi scheletrici in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata (25 °C). 3. Generazione di polvere ossea NOTA: I seguenti protocolli sono destinati all’uso nell’estrazione del DNA seguendo il protocollo26 di Dabney et al. 2019. Campionamento di pars petrosaNOTA: Questo protocollo è adattato dalle procedure descritte in Pinhasi et al. 20194 ed è presentato qui per facilità d’uso. Questo protocollo non rappresenta l’attuale metodo meno distruttivo per il campionamento di pars petrosa. Pertanto, si raccomanda di utilizzare il protocollo descritto da Sirak et al. 201713 o Orfanou et al. 202014 per i campioni in cui la conservazione morfologica è della massima importanza.Eseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza (lunghezza d’onda: 254 nm) con il flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire il foglio. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l’altro. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Fissare l’elemento asciutto e decontaminato utilizzando un morsetto o una morsa sterilizzata. Tagliare la pars petrosa a metà lungo il solco petroso superiore (vedi figura 1) usando una sega da gioielliere standard dotata di una lama da 0,6 mm (vedi tabella dei materiali) a velocità media per evitare il surriscaldamento (vedi NOTA sotto il punto 3.1.6).ATTENZIONE: La pars petrosa è molto densa, e come tale può essere difficile da tagliare. Fare attenzione a mantenere l’elemento saldamente bloccato per evitare lesioni. Smaltire le lame rotte nell’apposito recipiente per oggetti taglienti. Rimuovere le parti petrose dal morsetto. Recuperare e salvare qualsiasi materiale sciolto / in eccesso. Posizionare la carta pesata in un contenitore sterile Tenere la parte petrosa sulla carta da pesare, con il lato tagliato inclinato verso il vassoio. Forare l’osso corticale denso tra il canale facciale e l’antro mastoideo (appare più lucido del materiale circostante, vedi Figura 1) usando un trapano dentale dotato di una piccola punta di misura (vedi Tabella dei materiali) e impostato su velocità media, coppia media per produrre polvere ossea.NOTA: La perforazione / taglio deve essere eseguita in brevi raffiche a basse e medie velocità per evitare il surriscaldamento dell’osso e potenzialmente distruggere / danneggiare il DNA. Aneddoticamente, quando la parte densa del petroso inizia a surriscaldarsi, si può osservare un odore descritto come pancetta da cucina. Cessare immediatamente la perforazione/segatura e lasciare riposare l’osso fino a quando non si raffredda sufficientemente prima di riprendere. Ripetere la perforazione fino a quando circa 50-100 mg di polvere vengono raccolti nella carta pesata, misurati utilizzando una bilancia chiusa con una precisione di almeno 0,01 mg (vedere Tabella dei materiali).NOTA: Ove possibile, si consiglia di raccogliere 100 mg di polvere ossea per consentire l’estrazione di due repliche del DNA di 50 mg ciascuna. Tuttavia, ciò potrebbe non essere sempre possibile in base alla limitazione delle posizioni di campionamento anatomico stesse (ad esempio, la falange distale, la camera pulpare dentale) o alla necessità di conservazione morfologica. Per altre località, come il cemento, possono essere disponibili molto meno di 50 mg di materiale. Tuttavia, il cemento, la camera pulpare dentale e la falange distale hanno tutti dimostrato di produrre DNA endogeno significativo 11,27,28, nonostante un minore apporto iniziale di polvere ossea dal processo di estrazione. Trasferire la polvere dalla carta pesata a un tubo di sicurezza etichettato con 2 ml a bassa legatura per l’estrazione o lo stoccaggio. Conservare i campioni a -20 °C, a tempo indeterminato. Conservare l’osso residuo/polvere in eccesso in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata (25 °C) fino al completamento del rimpatrio/rimpatrio. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Sterilizzare/decontaminare tutte le attrezzature riutilizzabili (ad esempio, morsetti, punte da trapano, trapani, seghe, ecc.) utilizzando candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo ed esposizione UV (lunghezza d’onda: 254 nm), a seconda dei casi, tra ciascun campionamento. Figura 1: Osso temporale inclusa la pars petrosa. (A) Pretaglio del campione che mostra l’ubicazione della piramide petrosa e del solco petrosa. (B) Porzione petrosa post-taglio evidenziando le aree dense da perforare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Campionamento dei molari permanentiNOTA: Per il campionamento dei molari permanenti, preselezionare in situ Molari con radici fuse e idealmente privi di carie, crepe nello smalto o usura eccessiva per ottenere i migliori risultati. Rimuovere qualsiasi campionamento di calcoli dentali e conservare a -20 °C per eventuali analisi future del microbioma orale (procedura non trattata qui).Campionamento del cementoEseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza (lunghezza d’onda: 254 nm) con il flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire la pellicola. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l’altro. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Introdurre un foglio di carta da pesare in una teglia sterile. Tenere/fissare il molare decontaminato per lo smalto, radicare verso il basso, sopra un vassoio di pesata usando un morsetto portatile come una chiave regolabile (vedi Tabella dei materiali). Equipaggiare un trapano dentale con una ruota da taglio circolare diamantata. Con il trapano impostato su un’impostazione di velocità/coppia media, toccare leggermente il bordo della punta fino alla radice con un angolo di circa -20°. Raschiare verso il basso nel vassoio per rimuovere / raccogliere il materiale giallo più esterno dalla radice (cemento). Interrompere la raccolta quando il materiale più leggero (bianco) della dentina diventa visibile.NOTA: È importante abbinare la direzione di rotazione della punta di taglio rispetto al vassoio di raccolta per evitare che la polvere si aerosolizzi e potenzialmente sprechi il campione mancando completamente il vassoio. Il cemento è particolarmente ricco di DNA; Tuttavia, le rese tipiche del materiale sono molto più piccole rispetto ad altre posizioni di campionamento anatomico (~7-20 mg)11,27,28. Registrare la massa di polvere raccolta in carta pesata utilizzando una bilancia allegata con precisione di almeno 0,01 mg (vedere la tabella dei materiali). Trasferire la polvere dalla carta pesata a un tubo di bloccaggio sicuro da 2 mL per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Campionamento della camera pulpareDopo che il cemento è stato raccolto (se lo si desidera), sezionare il molare lungo la giunzione cemento-smalto usando una sega da gioielliere per rimuovere la corona (vedi Figura 2). Inserire un nuovo foglio di carta pesata in una nuova vaschetta di pesatura. Fissare la sezione della corona in un morsetto o morsa portatile, sopra il vassoio di pesatura. Tenere il lato tagliato inclinato verso il basso e perforare/raschiare il materiale come prima passata con un trapano dentale dotato di una punta di perforazione di piccolo spessore (vedere la tabella dei materiali) lungo i bordi della camera di polpa all’interno della porzione di corona (vedere Figura 2).NOTA: Solo il primo passaggio dell’interno della camera pulpare deve essere raccolto ed etichettato come materiale pulpare (resa tipica 5-15 mg), qualsiasi cosa più profonda nel dente è considerata dentina. Girare il dente con la parte inferiore rivolta verso il basso, picchiettare il morsetto con un martello e raccogliere la polvere liberata sulla carta da pesare. Registrare il peso della polvere raccolta nella carta pesata utilizzando una bilancia allegata accurata ad almeno 0,01 mg (vedere Tabella dei materiali). Trasferire la polvere dalla carta pesata a un tubo di sicurezza a bassa legatura da 2 ml per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Campionamento della dentinaInserire un nuovo foglio di carta pesata in una nuova vaschetta di pesatura. Tenere la sezione della corona sopra il vassoio di pesata (come da punto 3.2.2.3), forare e raccogliere altri 50-100 mg di dentina misurati utilizzando una bilancia chiusa accurata a 0,01 mg (vedere la tabella dei materiali) dall’interno della camera pulpare nello stesso modo per un ulteriore campionamento della dentina (vedere figura 2). Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo di sicurezza a basso legame da 2 ml per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Conservare i restanti pezzi di denti/polvere in eccesso in un ambiente asciutto e a temperatura controllata (25 °C) sterile fino al completamento del rimpatrio/rimpatrio. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Sterilizzare/decontaminare tutte le attrezzature riutilizzabili (ad esempio, morsetti, punte da trapano, trapani, seghe, ecc.) utilizzando candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo ed esposizioni UV (lunghezza d’onda: 254 nm), a seconda dei casi, tra ogni campionamento. Figura 2: Precampionamento molare permanente . (A) Molare pretrattato prima del campionamento, con indicazione della corona, del cemento (strato giallastro della radice) e del sito di taglio alla giunzione cemento-smalto. (B) La stessa collezione molare post-cemento, che mostra il sito di taglio alla giunzione cemento-smalto. (C) Post-taglio e campionamento molare che mostra le posizioni anatomiche di campionamento per la camera pulpare dentale e la dentina all’interno della corona. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Campionamento delle vertebre toracicheCampionamento del corpo vertebraleEseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza (lunghezza d’onda: 254 nm) con il flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire la pellicola. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l’altro. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Inserire un piccolo foglio di carta pesata in una vaschetta di pesata standard. Fissare le vertebre con un morsetto o una morsa a mano, con il corpo vertebrale verso l’esterno. Tenere le vertebre sopra il vassoio di pesata con il corpo vertebrale inclinato verso il basso. Utilizzando un trapano dentale dotato di una punta di perforazione di piccolo calibro (vedi Tabella dei materiali) impostata su una coppia elevata a bassa velocità, forare lungo il bordo più esterno (inferiore e superiore) dell’osso corticale che circonda il tessuto interno spugnoso del corpo vertebrale (vedere Figura 3). Raschiare la punta contro lo strato corticale su un vassoio di pesatura standard fino a raccogliere 50-100 mg di materiale, misurati utilizzando una bilancia chiusa accurata a 0,01 mg (vedere Tabella dei materiali). Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo di bloccaggio sicuro da 2 mL per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Campionamento dell’arco vertebrale superioreNota : questo passaggio è facoltativo. Rimuovere e scartare lo strato più esterno dell’osso corticale dell’arcata vertebrale superiore utilizzando un trapano dentale dotato di una punta di perforazione di piccolo calibro (vedi Tabella dei materiali) raschiandolo lungo la superficie19. Ciò non è raccomandato per il campionamento dal corpo vertebrale, poiché lo strato di osso corticale è generalmente molto sottile e probabilmente sarà completamente impoverito da questo processo (vedere NOTA nella sezione 2).Inserire un piccolo foglio di carta pesata in una vaschetta di pesata standard. Fissare le vertebre in un morsetto / morsa della mano con il processo vertebrale verso l’esterno, aspetto superiore verso il basso. Tenendo le vertebre, aspetto superiore verso il basso, sopra un vassoio di pesatura, forare verso l’alto il centro della tacca a forma di V formata dalla fusione del processo spinoso con le lamelle (vedi Figura 3) utilizzando un trapano dentale con una piccola punta di calibro (vedi Tabella dei materiali) impostata a bassa velocità e coppia elevata. Cessare la perforazione quando c’è un notevole calo della resistenza. Cambiare leggermente la posizione di foratura e ripetere fino a raccogliere 50-100 mg di polvere ossea, misurata utilizzando una bilancia chiusa accurata a 0,01 mg (vedere la tabella dei materiali). Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo a basso legame da 2 ml per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Conservare l’osso residuo/polvere in eccesso in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata (25 °C) fino al ritorno/rimpatrio. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Sterilizzare/decontaminare tutte le attrezzature riutilizzabili (ad esempio, morsetti, punte da trapano, trapani, seghe, ecc.) utilizzando candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo ed esposizione UV (lunghezza d’onda: 254 nm), a seconda dei casi, tra ciascun campionamento. Figura 3: Corpo vertebrale e arco vertebrale superiore posizioni di campionamento anatomico dell’osso corticale della vertebra toracica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Campionamento della falange distaleNota : questo passaggio è facoltativo. Rimuovere e scartare lo strato più esterno dell’osso corticale dell’albero e/o del ciuffo apicale utilizzando un trapano dentale dotato di una punta di perforazione di piccolo calibro raschiandolo lungo la superficie19. Ciò potrebbe non essere possibile per campioni con osso corticale eccessivamente sottile o resti giovanili (vedere NOTA nel paragrafo 2).Eseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata, sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza (lunghezza d’onda UV: 254 nm) con flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire la pellicola. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l’altro. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Inserire un piccolo foglio di carta pesata in una vaschetta di pesata standard. Fissare il campione in morsetto/morsa portatile, lato superiore verso l’alto. Tenere il campione sopra il vassoio di pesatura, raccogliere la polvere ossea dall’osso corticale dal lato inferiore del ciuffo apicale e dell’albero perforando gli strati più densi più esterni (vedere figura 4) utilizzando un trapano dentale dotato di una punta di perforazione di piccolo calibro (vedere la tabella dei materiali). Cessare la perforazione quando c’è una marcata diminuzione della resistenza, poiché ciò significa materiale più leggero e spugnoso. Ripetere questo processo, irradiando verso l’esterno dalla perforazione iniziale fino a raccogliere almeno 50-100 mg di polvere ossea, misurata utilizzando una bilancia chiusa accurata a 0,01 mg (vedere Tabella dei materiali). Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo di sicurezza a basso legame da 2 ml per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Conservare l’osso rimanente/polvere in eccesso in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata (25 °C) fino al ritorno/rimpatrio. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Sterilizzare/decontaminare tutte le attrezzature riutilizzabili (ad esempio, morsetti, punte da trapano, trapani, seghe, ecc.) utilizzando candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo ed esposizione ai raggi UV, a seconda dei casi, tra un campionamento e l’altro.NOTA: Per campioni più piccoli (ad esempio, campioni giovanili) ci può essere considerevolmente meno dei 50-100 mg di osso corticale suggeriti disponibili per il campionamento. Tuttavia, anche in piccole quantità, questa posizione di campionamento anatomico ha dimostrato di essere particolarmente ricca di DNA11. Figura 4: Falange distale che mostra le posizioni dell’osso corticale denso lungo l’asta e il lato inferiore del ciuffo apicale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Campionamento dell’astragaloEseguire tutti i campionamenti in una camera bianca dedicata sotto una cappa PCR dotata di luce UV o un armadio di biosicurezza (lunghezza d’onda: 254 nm) con il flusso d’aria disattivato. Stendere un foglio di alluminio sterile sul piano di lavoro per catturare eventuali polvere / frammenti di ossa vaganti. Assicurarsi che tutti i frammenti ossei e quanta più polvere possibile siano recuperati (per il rimpatrio) prima di smaltire la pellicola. Cambiare la pellicola tra un campionamento e l’altro. Smaltire la pellicola usata in una borsa/recipiente autoclavabile a rischio biologico. Inserire un piccolo foglio di carta pesata in una vaschetta di pesata standard. Fissare il campione in morsetto/morsa portatile, cupola verso l’alto. Tenere l’astragalo, la cupola verso l’alto e la superficie mediale verso il collettore, sopra il vassoio di pesatura. Raschiare l’osso corticale dal collo dell’astragalo ad una profondità di ~ 1 mm (vedi Figura 5) usando un trapano dentale con una punta a basso spessore (vedi Tabella dei materiali) impostata su bassa velocità e coppia elevata. Cambiare leggermente la posizione di perforazione e ripetere fino a raccogliere circa 50-100 mg di polvere ossea, misurata utilizzando una bilancia chiusa con precisione di 0,01 mg (vedere la tabella dei materiali). Trasferire la polvere ossea dalla carta pesata a un tubo a basso legame da 2 ml per l’estrazione. Conservare a -20 °C, per un periodo indefinito. Conservare l’osso rimanente/polvere in eccesso in un ambiente sterile asciutto e a temperatura controllata (25 °C) fino al completamento del rimpatrio/rimpatrio. Smaltire tutti i rifiuti in sacchetti o recipienti autoclavabili a rischio biologico. Sterilizzare/decontaminare tutte le attrezzature riutilizzabili (ad esempio, morsetti, punte da trapano, trapani, seghe, ecc.) utilizzando candeggina/soluzione di decontaminazione del DNA/etanolo ed esposizione UV (lunghezza d’onda: 254 nm), a seconda dei casi, tra ciascun campionamento. Figura 5: Area di campionamento dell’astragalo per il recupero dell’osso corticale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. NOTA: L’astragalo ha pochissimo osso corticale (uno strato esterno sottile). Il materiale non dovrebbe essere raccolto solo dalla superficie, ma anche dallo strato denso sottostante di osso spugnoso.