考古学的遺跡から古代DNAを検索するための最適化された骨サンプリングプロトコル

ここに提示されたすべての研究は、ドイツのイエナにあるマックスプランク人類史科学研究所が古代の人間の遺体を扱うために定めたガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルのステップを実行する前に、科学的研究の許可の取得と、お住まいの地域での破壊的なサンプリングのための人間の遺体の使用の両方に関連するすべての地方/州/連邦の倫理要件を順守するようにしてください。すべての手順/化学物質の保管は、個々の施設の安全ガイドラインに従って実行する必要があります。 1. サンプル処理前の考慮事項 古代の遺跡は複製不可能で有限のリソースであるため、サンプルは慎重に扱います(たとえば、サンプリングは可能な限り無駄を最小限に抑え、可能であればすべての遺骨をそれぞれの合法的なプロバイダーに返却する必要があります)。 すべてのステップはクリーンルーム環境、できれば専用の古代DNA施設で実行してください17,18,19。フード付きの滅菌微孔性つなぎ服、滅菌手袋(2ペア)、サージカルマスク、保護眼鏡、滅菌カバー付きの滅菌ブーツまたは滑り止め靴で構成される個人用保護具(PPE)を使用してください(材料の表を参照)。特にサンプル間で手袋を頻繁に交換してください。 可能な場合は、漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV照射(波長:254 nm)ですべての機器と表面を完全に洗浄および消毒します(例:ドリルビット、ドリル、バイス/クランプなど)。最後に、クリーンルーム環境による過度の疲労を避けるために、定期的に人間工学に基づいた休憩(可能であれば2〜3時間ごと)を取ることを強くお勧めします。注:すべての骨格の遺体は、サンプリングの前に適切に文書化する必要があります(たとえば、写真撮影、計量、可能であればマイクロCTスキャン、3D画像化など)(適切な文書化のプロトコルはこの原稿ではカバーされていません)。すべてのサンプリングプロトコルは、サンプリング反復の間に一時停止することができ、サンプルは乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に無期限に保存できます。 2.前処理 骨粉を生成する前にすべての解剖学的サンプリング場所を除染して、汚染のリスクを最小限に抑えます18。注:サンプル除染のための漂白剤および/または表面除去の有効性(表面除去手順についてはステップ3.3.2の注を参照)は、aDNA研究者の間でまだ議論の的となっています8,19,20,21,22,23,24,25は、特に高度に分解されたサンプルで全体的なDNA収量に影響を与える可能性があるためです。そのため、次の手順はオプションと見なされ、このホワイト ペーパーで示されている代表的な結果を生成するためにすべてのサンプルで使用されたため、ここに含まれています。これらの前処理プロトコルの使用は、各サンプルセットの分子用途、年齢、希少性、および形態学的劣化のレベルに基づいて、ケースバイケースで決定することをお勧めします。UV光を備えたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)フードまたはエアフローをオフにしたバイオセーフティキャビネットの下、専用のクリーンルームですべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各骨格要素の処理間でホイルを変更します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 糸くずの出ない乾いた滅菌ワイプでその領域をそっと拭いて、解剖学的サンプリング場所からできるだけ多くの緩い汚れ/残骸を取り除きます( 材料の表を参照)。ワイプは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて廃棄してください。 希釈した市販の漂白剤(~0.01% v/v、超高純度のDNase/RNaseフリー水で希釈)で湿らせた滅菌ワイプで拭いて洗浄した表面を除染し、5分間インキュベートします。ワイプは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて廃棄してください。注意: 漂白剤は非常に腐食性と反応性の化学物質です。したがって、使用前に適切な安全対策を講じる必要があります。 超高純度のDNase/RNaseフリー水で湿らせた滅菌ワイプを使用して、解剖学的サンプリング場所からできるだけ多くの残留漂白剤を取り除きます。ワイプは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて廃棄してください。 洗浄したすべての解剖学的サンプリング場所をUV放射(波長:254 nm)に30分間さらした後、室温で完全に乾燥させます。骨粉の生成を容易にするだけでなく、サンプルのさらなる劣化(カビなど)を防ぐために、サンプリングを続行したり保管に戻したりする前に、解剖学的サンプリング場所が完全に乾いていることを確認してください。注意: 紫外線にさらされると、目に害を及ぼす可能性があります。 すぐにサンプリングに移動するか、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に骨格要素を保管してください。 3.骨粉の生成 注:以下のプロトコルは、Dabney et al. 2019プロトコル26に従ったDNA抽出での使用を目的としています。 のサンプリング pars petrosa注:このプロトコルは、Pinhasi et al. 2019に記載されている手順から適応されています。4 使いやすさのためにここに提示されています。このプロトコルは、サンプリングのための現在の最も破壊的な方法を表すものではありません。 pars petrosa.そのため、Sirak et al. 2017で説明されているプロトコルを使用することをお勧めします。13 またはオルファノウら202014 形態学的保存が最も重要であるサンプル用。UVライトを備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネット(波長:254 nm)の下にある専用のクリーンルームで、エアフローをオフにしてすべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各サンプリング間でフォイルを交換します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 滅菌されたクランプまたは万力を使用して、乾燥した除染された要素を固定します。 過熱を避けるために、0.6 mmの刃(材料表を参照)を備えた標準の宝石商のこぎりを使用して、上溝のペトロサス(図1を参照)に沿ってパースペトロサを中速で半分にカットします(手順3.1.6の下の注を参照)。注意: パースペトロサ は非常に密度が高いため、切断が難しい場合があります。怪我をしないように、エレメントをしっかりと固定しておくように注意してくださいamp。壊れた鋸刃は、適切な鋭利物のレセプタクルに廃棄してください。 クランプから錐体部分を取り外します。緩い/余分な材料を回収して保存します。 計量紙を滅菌計量ボートに入れます 錐体部分を計量紙の上にかざし、切断面を計量トレイに向かって傾けます。小さなゲージビット(材料の表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、顔面管と乳様突起前庭の間の密な皮質骨(周囲の材料よりも光沢があるように見える、図1を参照)にドリルで穴を開け、中速、中トルクに設定して骨粉を生成します。注意: 穴あけ/切断は、骨の過熱やDNAの破壊/損傷の可能性を避けるために、低速から中速で短いバーストで実行する必要があります。逸話的に、石油の密な部分が過熱し始めると、ベーコンを調理すると説明される臭いが観察されることがあります。すぐに穴あけ/鋸引きを中止し、再開する前に十分に冷えるまで骨を休ませます。 少なくとも50 mgの精度の密閉天びんを使用して測定された、約100〜0.01 mgの粉末が計量紙に収集されるまで、穴あけを繰り返します( 材料の表を参照)。注:可能であれば、それぞれ50 mgの複製DNA抽出を2回行うために、100 mgの骨粉末を収集することをお勧めします。しかしながら、これは、解剖学的サンプリング位置自体の制限(例えば、遠位指節骨、歯髄室)または形態学的保存の必要性のいずれかに基づいて常に可能であるとは限らない。セメント質などの他の場所では、50mg未満の材料が利用できる場合があります。しかし、セメント質、歯髄室、および遠位指骨はすべて、抽出プロセスからの骨粉末の初期投入量が少ないにもかかわらず、有意な内因性DNA11、27、28を生成することが示されています。 計量紙から2 mLのラベル付きローバインドセーフロックチューブに粉末を移し、抽出または保管します。サンプルは-20°Cで無期限に保管してください。 残りの骨/余分な粉末は、返却/本国送還が完了するまで、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に保管してください。 すべての廃棄物は、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。各サンプリングの間に、漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV(波長:254 nm)曝露(該当する場合)を使用して、すべての再利用可能な機器(クランプ、ドリルビット、ドリル、のこぎりなど)を滅菌/除染します。 図1: ペトロサを含む側頭骨。 (A)錐体ピラミッドと 溝ペトロサ の位置を示すサンプルプレカット。(B)掘削する密集した領域を強調するペトラス部分の切断後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 永久大臼歯のサンプリング注意: 永久大臼歯のサンプリングについては、事前に選択してください in situ 根が融合し、理想的には虫歯、エナメル質のひび割れ、または最良の結果を得るための過度の摩耗がない大臼歯。歯石のサンプリングをすべて取り除き、口腔微生物叢の将来の分析のために-20°Cで保管します(手順はここでは説明しません)。セメント質のサンプリングUVライトを備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネット(波長:254 nm)の下にある専用のクリーンルームで、エアフローをオフにしてすべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各サンプリング間でフォイルを交換します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 計量紙のシートを滅菌計量トレイに入れます。 除染された大臼歯をエナメル質で保持/固定し、幅を下にして、モンキーレンチなどのハンドヘルドクランプを使用して計量トレイの上に置きます(材料の表を参照)。 歯科用ドリルにダイヤモンドエッジの円形カッティングホイールを装備します。ドリルを中速/トルク設定に設定した状態で、ビットの端を約-20°の角度で根元に軽く触れます。 トレイに下向きにこすり落とし、根元(セメント質)から黄色の最も外側の材料を除去/収集します。象牙質の軽い(白い)材料が見えるようになったら、収集を停止します。注意: 粉末がエアロゾル化され、トレイを完全に失うことでサンプルを無駄にする可能性があるため、収集トレイに対して切断ビットの回転方向を一致させることが重要です。セメント質は特にDNAが豊富です。ただし、材料の典型的な収量は、他の解剖学的サンプリング場所(~7-20 mg)よりもはるかに小さい11,27,28。 少なくとも0.01 mgの精度の同封天びんを使用して、計量紙に収集された粉末の質量を記録します( 材料の表を参照)。 計量紙から2 mLの低バインドで安全なロックチューブに粉末を移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 パルプチャンバーのサンプリングセメント質が収集されたら(必要に応じて)、宝石商のこぎりを使用してセメントとエナメルの接合部に沿って大臼歯を切断し、リューズを取り外します( 図2を参照)。 新しい計量トレイに新しい計量用紙を置きます。 クラウンセクションをハンドヘルドクランプまたは万力で計量トレイの上に固定します。切断面を下に傾けて保持し、クラウン部分内の歯髄チャンバーの端に沿って小さなゲージの穴あけビット( 材料の表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、最初のパスとして材料をドリル/スクレイピングします( 図2を参照)。注:歯髄室の内部の最初のパスのみが収集され、パルプ材料(5〜15 mgの典型的な収量)としてラベル付けされ、歯の奥深くにあるものはすべて象牙質と見なされます。 下部を下に向けて歯を回し、クランプをハンマーで叩き、遊離した粉末を計量紙に集めます。 少なくとも0.01mgの精度の同封天秤を使用して、計量紙に収集された粉末の重量を記録します(材料の表を参照)。 粉末を計量紙から2 mLの低バインドセーフロックチューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 象牙質のサンプリング新しい計量トレイに新しい計量用紙を置きます。 クラウンセクションを計量トレイの上に保持し(ステップ3.2.2.3に従って)、ドリルアウトして、さらに象牙質サンプリングのために同じ方法で、0.01 mg( 材料の表を参照)に正確な同封天びんを使用して測定された50〜100 mgの象牙質を収集します( 図2を参照)。 骨粉末を計量紙から2 mLのローバインドセーフロックチューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 残りの歯片/余分な粉末は、返却/本国送還が完了するまで、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に保管してください。 すべての廃棄物は、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。各サンプリングの間に、必要に応じて漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV(波長:254 nm)曝露を使用して、すべての再利用可能な機器(クランプ、ドリルビット、ドリル、のこぎりなど)を滅菌/除染します。 図2:永久大臼歯の事前 サンプリング。 (A)サンプリング前に前処理された大臼歯、クラウン、セメント質(根の黄色がかった層)、およびセメント-エナメル接合部の切断部位を示します。(B)同じモルポストセメントムコレクションで、セメント-エナメル接合部における切断部位を示す。(C)歯冠内の歯髄室と象牙質の解剖学的サンプリング位置を示す臼歯の切断後およびサンプリング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 胸椎のサンプリング椎体のサンプリングUVライトを備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネット(波長:254 nm)の下にある専用のクリーンルームで、エアフローをオフにしてすべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各サンプリング間でフォイルを交換します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。 椎体を外側にして、クランプまたはハンドバイスで椎骨を固定します。 椎体を下に傾けた状態で、椎骨を計量トレイの上にかざします。低速高トルクに設定された小さなゲージドリルビット( 材料表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、椎体の海綿状内部組織を囲む皮質骨の最外縁(下および上)に沿ってドリルします( 図3を参照)。 0.01 mgの精度の同封天びんを使用して測定した50〜100 mgの材料が収集されるまで、標準の重み付けトレイで皮質層に対してビットをこすります( 材料の表を参照)。 骨粉末を計量紙から2 mLのローバインドで安全なロックチューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 上椎弓のサンプリング注: この手順はオプションです。上椎弓の皮質骨の最外層を、小さなゲージのドリルビット( 材料表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、表面に沿って削り取って除去します19。皮質骨の層は一般的に非常に薄く、このプロセスによって完全に枯渇する可能性があるため、これは椎体からのサンプリングには推奨されません(セクション2の注を参照)。計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。 椎骨をハンドクランプ/万力で固定し、椎骨突起を外側に、上面を下に向けて固定します。 椎骨を上方面下に保持しながら、計量トレイ上で、低速および高トルクに設定された小さなゲージビット(材料表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、棘突起とラメラ(図3を参照)の融合によって形成されたV字型のノッチの中央にドリルアップします。 抵抗が著しく低下した場合は、掘削を中止してください。穴あけ位置を少し変更し、0.01 mgの精度の密閉天びんを使用して測定した50〜100 mgの骨粉が収集されるまで繰り返します( 材料の表を参照)。 骨粉末を計量紙から2 mLの低結合チューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 残りの骨/余分な粉末は、返却/本国送還されるまで、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に保管してください。 すべての廃棄物は、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。各サンプリングの間に、漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV(波長:254 nm)曝露(該当する場合)を使用して、すべての再利用可能な機器(クランプ、ドリルビット、ドリル、のこぎりなど)を滅菌/除染します。 図3:椎体と上椎弓皮質骨の胸椎の解剖学的サンプリング位置。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 遠位指節骨のサンプリング注: この手順はオプションです。シャフトおよび/または頂端房の皮質骨の最外層を、表面に沿って削り取ることによって小さなゲージの穴あけビットを備えた歯科用ドリルを使用して除去し、廃棄する19。これは、皮質骨が過度に薄いサンプルや若年遺体では不可能な場合があります(セクション2の注を参照)。UVライトを備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネット(UV波長:254 nm)の下で、エアフローをオフにして、専用のクリーンルームですべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各サンプリング間でフォイルを交換します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。 サンプルをハンドヘルドクランプ/バイスで上側に固定します。 サンプルを計量トレイにかざし、小さなゲージドリルビットを備えた歯科用ドリルを使用して最も外側の密な層( 図4を参照)をドリルで開けて、頂端の房とシャフトの下側から皮質骨から骨粉を収集します( 材料表を参照)。 抵抗が著しく減少した場合は、より軽くて海綿状の材料を意味するため、穴あけを中止してください。このプロセスを繰り返し、0.01 mgの精度の密閉天びんを使用して測定した、少なくとも50〜100 mgの骨粉が収集されるまで、最初の穴あけから外側に放射します( 材料の表を参照)。 骨粉末を計量紙から2 mLのローバインドセーフロックチューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 残りの骨/余分な粉末は、返却/本国送還まで、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に保管してください。. すべての廃棄物は、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。各サンプリングの間に、必要に応じて漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV曝露を使用して、すべての再利用可能な機器(クランプ、ドリルビット、ドリル、のこぎりなど)を滅菌/除染します。注:より小さなサンプル(例:.、若年サンプル)の場合、サンプルに利用できる皮質骨の推奨50〜100mgよりもかなり少ない場合があります。しかし、少量であっても、この解剖学的サンプリング場所はDNA11が特に豊富であることが示されています。 図4:先端房のシャフトと下側に沿った密な皮質骨の位置を示す遠位指節骨。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 距骨のサンプリングUVライトを備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネット(波長:254 nm)の下にある専用のクリーンルームで、エアフローをオフにしてすべてのサンプリングを実行します。ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉/破片をキャッチします。 ホイルを処分する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が(本国送還のために)回収されていることを確認してください。各サンプリング間でフォイルを交換します。使用済みのホイルは、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ/レセプタクルに入れて廃棄してください。 計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。 サンプルをハンドヘルドクランプ/万力で固定し、ドームを上向きにします。 距骨、ドームを上向きに保持し、内側の表面をコレクターに向かって、計量トレイの上に置きます。低速および高トルクに設定された低ゲージビット(材料表を参照)を備えた歯科用ドリルを使用して、距骨の頸部から~1 mmの深さまで皮質骨をこすり落とします(図5を参照)。 穴あけ位置を少し変更し、0.01 mgの精度の密閉天びんを使用して測定した約50〜100 mgの骨粉が収集されるまで繰り返します( 材料の表を参照)。 骨粉末を計量紙から2 mLの低結合チューブに移して抽出します。-20°Cで無期限に保管してください。 残りの骨/余分な粉末は、返却/本国送還が完了するまで、乾燥した温度制御された(25°C)無菌環境に保管してください。. すべての廃棄物は、オートクレーブ可能なバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。各サンプリングの間に、漂白剤/DNA除染溶液/エタノールおよびUV(波長:254 nm)曝露(該当する場合)を使用して、すべての再利用可能な機器(クランプ、ドリルビット、ドリル、のこぎりなど)を滅菌/除染します。 図5:皮質骨回復のための距骨のサンプリング領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 注:距骨には皮質骨(薄い外層)がほとんどありません。材料は表面からだけでなく、海綿骨の下にある密な層からも収集する必要があります。