Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro

A sinalização Wnt não canônica é uma via conservada evolutivamente que regula a organização do filamento celular e a migração direcional. Essa via tem sido implicada em múltiplos processos biológicos, incluindo morfogênese do tecido embrionário ^1,2,3, angiogênese linfática e vascular ^4,5,6,7 e crescimento e metástase do câncer 8,9,10 . No nível celular, a sinalização Wnt não canônica é realizada através de interações parácrinas coordenadas entre as células emissoras e receptoras de sinal. Essas interações ocorrem frequentemente entre células de diferentes linhagens ou tipos e envolvem uma rede molecular diversificada que inclui até 19 ligantes e múltiplos receptores, co-receptores e efetores de transdução de sinal a jusante¹¹. Complicando ainda mais esse processo de sinalização, estudos anteriores mostraram que as combinações ligante-receptor podem variar de maneira dependente do contexto e do tecido 12,13, e que os mesmos ligantes de origem que acionam a sinalização Wnt não canônica em células receptoras de sinal podem ser produzidos por múltiplos tipos de células emissoras de sinal ^14,15 . Dada a complexidade celular e molecular associada à sinalização Wnt não canônica, a capacidade de estudar mecanismos individuais e clinicamente relevantes in vivo tem sido limitada.

Tentativas têm sido feitas para estudar a sinalização Wnt não canônica usando técnicas de cultura de células in vitro. Por exemplo, ensaios de cicatrização de feridas realizados em monocamadas celulares têm sido utilizados para avaliar funcionalmente a migração direcional celular 4,16,17,18,19. Técnicas de imunocoloração têm sido utilizadas para realizar análises espaciais da expressão de proteínas de superfície para avaliar alterações não canônicas induzidas por Wnt na morfologia celular 7,10, arquitetura e polarização assimétrica^18,19,20. Embora essas abordagens tenham fornecido ferramentas importantes para caracterizar fenótipos relacionados à Wnt em células receptoras de sinal, a falta de componentes emissores de sinal nesses protocolos limita sua capacidade de modelar com precisão os mecanismos de sinalização parácrina observados in vivo. Como resultado, permanece uma necessidade crítica de desenvolver sistemas in vitro que permitam uma avaliação robusta e reprodutível das interações de sinalização parácrina entre células emissoras e receptoras de sinais da via Wnt não canônica, particularmente aquelas de diferentes tipos celulares.

Para tanto, o objetivo primário deste estudo foi estabelecer um protocolo para modelar interações de sinalização Wnt não canônicas parácrinas in vitro. Desenvolvemos um sistema de cocultura sem contato que recapitula os componentes de envio e recepção de sinal dessas interações e permite o uso de abordagens moleculares, genéticas ou farmacológicas padrão para estudar independentemente mecanismos específicos de ligantes-receptores na via Wnt não canônica. Os mecanismos de sinalização Wnt mediada por NCC foram examinados em mioblastos usando linhagens celulares murinas estabelecidas. Como prova de princípio, este modelo foi utilizado para corroborar achados de estudos in vivo prévios em camundongos que implicam o eixo Wnt5a-ROR2 como uma via de sinalização Wnt não canônica relevante entre os NCCs²¹ e os progenitores cardiomioblastos SHF 3,22,23.