מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה
Summary
המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה. פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.
Abstract
איתות Wnt לא-קנוני מווסת את ארגון חוטי האקטין התוך-תאיים ואת הנדידה המקוטבת של תאי אב במהלך העובר. תהליך זה דורש אינטראקציות פרקריניות מורכבות ומתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. בהתחשב בכך שאינטראקציות אלה יכולות להתרחש בין סוגים שונים של תאים משושלות שונות, הערכת in vivo של פגמים ספציפיים לתאים יכולה להיות מאתגרת. המחקר הנוכחי מתאר שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכת איתות Wnt פרקריני לא-קנוני במבחנה. פרוטוקול זה תוכנן עם היכולת (1) לבצע הערכות פונקציונליות ומולקולריות של איתות Wnt לא-קנוני בין כל שני סוגי תאים בעלי עניין; (2) לנתח את התפקיד של מולקולות שולחות אותות לעומת מולקולות קולטות אותות במסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt; ו-(3) לבצע ניסויי הצלה פנוטיפיים בגישות מולקולריות או פרמקולוגיות סטנדרטיות.
פרוטוקול זה שימש להערכת איתות Wnt לא-קנוני בתיווך תאי עצב (NCC) במיובלסטים. נוכחותם של NCCs קשורה למספר מוגבר של פילופודיה ציטופלסמית חיובית לפלואידין ולמליפודיה במיובלסטים ונדידת מיובלסטים משופרת בבדיקת ריפוי פצעים. ציר Wnt5a-ROR2 זוהה כמסלול איתות Wnt לא-קנוני חיוני בין NCC לבין אבות קרדיומיובלסטים בשדה הלב השני (SHF). לסיכום, זהו פרוטוקול נוח מאוד לחקר מנגנוני איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.
Introduction
איתות Wnt לא-קנוני הוא מסלול משומר אבולוציונית המווסת את ארגון החוטים התאיים ואת ההגירה הכיוונית. מסלול זה היה מעורב בתהליכים ביולוגיים מרובים, כולל מורפוגנזה של רקמה עוברית 1,2,3, אנגיוגנזה לימפטית וכלי דם 4,5,6,7, וצמיחת סרטן וגרורות 8,9,10 . ברמה התאית, איתות Wnt לא-קנוני מתבצע באמצעות אינטראקציות פרקריניות מתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. אינטראקציות אלה מתרחשות לעתים קרובות בין תאים של שושלות או סוגים שונים ומערבות רשת מולקולרית מגוונת הכוללת עד 19 ליגנדות וקולטנים מרובים, קולטנים משותפים ואפקטים של התמרת אותות במורד הזרם11. מה שמסבך עוד יותר את תהליך האיתות הזה, מחקרים קודמים הראו כי שילובי ליגנד-קולטן יכולים להשתנות באופן תלוי הקשר ורקמות 12,13, וכי אותן ליגנדות מקור המניעות איתות Wnt לא-קנוני בתאים קולטי אותות יכולות להיות מיוצרות על ידי מספר סוגי תאים השולחים אותות 14,15 . בהתחשב במורכבות התאית והמולקולרית הקשורה לאיתות Wnt לא-קנוני, היכולת לחקור מנגנונים אינדיבידואליים ורלוונטיים מבחינה קלינית in vivo הייתה מוגבלת.
נעשו ניסיונות לחקור איתות Wnt לא-קנוני באמצעות טכניקות של תרביות תאים במבחנה. לדוגמה, מבחני ריפוי פצעים שבוצעו במונולרים תאיים שימשו להערכה פונקציונלית של נדידה כיוונית תאית 4,16,17,18,19. טכניקות אימונוסטינינג שימשו לביצוע ניתוחים מרחביים של ביטוי חלבונים על פני השטח כדי להעריך שינויים שאינם נגרמים על ידי Wnt במורפולוגיה תאית 7,10, ארכיטקטורה וקיטוב אסימטרי18,19,20. אף על פי שגישות אלה סיפקו כלים חשובים לאפיון פנוטיפים הקשורים ל-Wnt בתאים קולטי אותות, היעדרם של רכיבים השולחים אותות בפרוטוקולים אלה מגביל את יכולתם ליצור מודלים מדויקים של מנגנוני איתות פראקריניים שנצפו in vivo. כתוצאה מכך, עדיין קיים צורך קריטי בפיתוח מערכות חוץ גופיות המאפשרות הערכה איתנה וניתנת לשחזור של אינטראקציות איתות פראקריניות בין תאים השולחים אותות וקולטים של מסלול Wnt הלא-קנוני, במיוחד אלה של סוגי תאים שונים.
לשם כך, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה ליצור פרוטוקול למודל אינטראקציות איתות Wnt לא-קנוניות במבחנה. פיתחנו מערכת קולקולטורה ללא מגע המשחזרת רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות אלה ומאפשרת שימוש בגישות מולקולריות, גנטיות או פרמקולוגיות סטנדרטיות כדי לחקור באופן עצמאי מנגנוני קולטני ליגנד ספציפיים במסלול Wnt הלא-קנוני. מנגנונים של איתות Wnt בתיווך NCC נבדקו במיובלסטים באמצעות קווי תאי מורין מבוססים. כהוכחה עקרונית, מודל זה שימש כדי לאשש ממצאים של מחקרי in vivo קודמים בעכברים המרמזים על ציר Wnt5a-ROR2 כמסלול איתות Wnt לא-קנוני רלוונטי בין NCCs 21 לבין אבות קרדיומיובלסטים SHF 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
מסלול האיתות הלא-קנוני Wnt/קוטביות התא המישורי (PCP) הוא מסלול איתות תאי בעל חשיבות קריטית שהיה מעורב במספר תהליכים התפתחותיים 24,25 ומחלות 24,26. במהלך ההתפתחות העוברית, איתות Wnt לא-קנוני כולל רשת נרחבת של אותות מולקולריים מתאי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F30HL154324 ל- O.T. ו- K08HL121191 ו- R03HL154301 ל- S.R.K. המחברים רוצים להכיר בכך שהסכימה באיור 1 בכתב היד הזה נוצרה עם biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
