Modellering Paracriene Niet-canonische Wnt Signalering In Vitro
Summary
De huidige studie schetst een zeer reproduceerbare en handelbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsgebeurtenissen in vitro te bestuderen. Dit protocol werd toegepast om de impact van paracriene Wnt5a-signalering in muizenneuraalcellen en myoblasten te evalueren.
Abstract
Niet-canonische Wnt-signalering reguleert de intracellulaire actinefilamentorganisatie en gepolariseerde migratie van voorlopercellen tijdens embryogenese. Dit proces vereist complexe en gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Aangezien deze interacties kunnen optreden tussen verschillende soorten cellen uit verschillende afstammingslijnen, kan in vivo evaluatie van celspecifieke defecten een uitdaging zijn. De huidige studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren. Dit protocol is ontworpen met de mogelijkheid om (1) functionele en moleculaire beoordelingen uit te voeren van niet-canonische Wnt-signalering tussen twee celtypen van belang; (2) de rol van signaalzendende versus signaal-ontvangende moleculen in de niet-canonische Wnt-signaleringsroute te ontleden; en (3) fenotypische reddingsexperimenten uitvoeren met standaard moleculaire of farmacologische benaderingen.
Dit protocol werd gebruikt om neurale crest cell (NCC)-gemedieerde niet-canonische Wnt-signalering in myoblasten te evalueren. De aanwezigheid van NCC’s is geassocieerd met een verhoogd aantal falloïdine-positieve cytoplasmatische filopodia en lamellipodie in myoblasten en verbeterde myoblastmigratie in een wondgenezingstest. De Wnt5a-ROR2-as werd geïdentificeerd als een cruciale niet-canonische Wnt-signaleringsroute tussen NCC en tweede hartveld (SHF) cardiomyoblastvoorlopers. Kortom, dit is een zeer handelbaar protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsmechanismen in vitro te bestuderen.
Introduction
Niet-canonische Wnt-signalering is een evolutionair geconserveerde route die de organisatie van cellulair filament en directionele migratie reguleert. Deze route is betrokken bij meerdere biologische processen, waaronder embryonale weefselmorfogenese 1,2,3, lymfatische en vasculaire angiogenese 4,5,6,7, en kankergroei en metastase 8,9,10 . Op cellulair niveau wordt niet-canonische Wnt-signalering uitgevoerd door gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Deze interacties komen vaak voor tussen cellen van verschillende afstammingslijnen of typen en omvatten een divers moleculair netwerk dat tot 19 liganden en meerdere receptoren, co-receptoren en downstream signaaltransductie-effectoren omvat11. Om dit signaleringsproces verder te compliceren, hebben eerdere studies aangetoond dat ligand-receptorcombinaties op een context- en weefselafhankelijke manier kunnen variëren12,13, en dat dezelfde bronliganden die niet-canonische Wnt-signalering in signaal-ontvangende cellen aandrijven, kunnen worden geproduceerd door meerdere signaalzendende celtypen14,15 . Gezien de cellulaire en moleculaire complexiteit geassocieerd met niet-canonische Wnt-signalering, is het vermogen om individuele en klinisch relevante mechanismen in vivo te bestuderen beperkt.
Er zijn pogingen gedaan om niet-canonische Wnt-signalering te bestuderen met behulp van celkweektechnieken in vitro. Wondgenezingstests uitgevoerd in cellulaire monolagen zijn bijvoorbeeld gebruikt om cellulaire directionele migratie functioneel te beoordelen 4,16,17,18,19. Immunostaining-technieken zijn gebruikt om ruimtelijke analyses van oppervlakte-eiwitexpressie uit te voeren om niet-canonische Wnt-geïnduceerde veranderingen in cellulaire morfologie 7,10, architectuur en asymmetrische polarisatie 18,19,20 te evalueren. Hoewel deze benaderingen belangrijke hulpmiddelen hebben geboden voor het karakteriseren van Wnt-gerelateerde fenotypen in signaalontvangstcellen, beperkt het gebrek aan signaalzendende componenten in deze protocollen hun vermogen om paracriene signaleringsmechanismen die in vivo worden waargenomen nauwkeurig te modelleren. Als gevolg hiervan blijft er een kritieke behoefte om in vitro systemen te ontwikkelen die een robuuste en reproduceerbare evaluatie van paracriene signaleringsinteracties tussen signaal-verzendende en ontvangende cellen van de niet-canonische Wnt-route mogelijk maken, met name die van verschillende celtypen.
Hiertoe was het primaire doel van deze studie het opstellen van een protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsinteracties in vitro te modelleren. We ontwikkelden een contactloos cocultuursysteem dat signaalzendende en signaalontvangstcomponenten van deze interacties samenvat en het gebruik van standaard moleculaire, genetische of farmacologische benaderingen mogelijk maakt om onafhankelijk specifieke ligandreceptormechanismen in de niet-canonische Wnt-route te bestuderen. Mechanismen van NCC-gemedieerde Wnt-signalering werden onderzocht in myoblasten met behulp van gevestigde muizencellijnen. Als bewijs van het principe werd dit model gebruikt om bevindingen van eerdere in vivo studies bij muizen te bevestigen die de Wnt5a-ROR2-as impliceren als een relevante niet-canonieke Wnt-signaleringsroute tussen NCC’s21 en SHF cardiomyoblastvoorlopers 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
De niet-canonische Wnt/planaire celpolariteit (PCP) signaleringsroute is een uiterst belangrijke cellulaire signaleringsroute die betrokken is bij meervoudige ontwikkelingsprocessen24,25 en ziekteprocessen24,26. Tijdens de embryonale ontwikkeling omvat niet-canonische Wnt-signalering een uitgebreid netwerk van moleculaire signalen van signaalzendende cellen die uiteindelijk veranderingen in morfo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F30HL154324 aan O.T. en K08HL121191 en R03HL154301 aan S.R.K. De auteurs willen graag erkennen dat het schema in figuur 1 in dit manuscript is gemaakt met biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
