Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro
Summary
Il presente studio delinea un metodo altamente riproducibile e trattabile per studiare gli eventi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro. Questo protocollo è stato applicato per valutare l’impatto della segnalazione paracrina Wnt5a nelle cellule della cresta neurale murina e nei mioblasti.
Abstract
La segnalazione Wnt non canonica regola l’organizzazione intracellulare del filamento di actina e la migrazione polarizzata delle cellule progenitrici durante l’embriogenesi. Questo processo richiede interazioni paracrine complesse e coordinate tra le cellule che inviano e ricevono il segnale. Dato che queste interazioni possono verificarsi tra vari tipi di cellule di diversi lignaggi, la valutazione in vivo dei difetti specifici delle cellule può essere difficile. Il presente studio descrive un metodo altamente riproducibile per valutare la segnalazione Wnt paracrina non canonica in vitro. Questo protocollo è stato progettato con la capacità di (1) condurre valutazioni funzionali e molecolari della segnalazione Wnt non canonica tra due tipi di cellule di interesse; (2) analizzare il ruolo delle molecole che inviano il segnale rispetto a quelle che ricevono il segnale nella via di segnalazione Wnt non canonica; e (3) eseguire esperimenti fenotipici di salvataggio con approcci molecolari o farmacologici standard.
Questo protocollo è stato utilizzato per valutare la segnalazione Wnt non canonica mediata dalle cellule della cresta neurale (NCC) nei mioblasti. La presenza di NCC è associata ad un aumento del numero di filopodi citoplasmatici e lamellipodi positivi alla falloidina nei mioblasti e a una migliore migrazione dei mioblasti in un test di guarigione delle ferite. L’asse Wnt5a-ROR2 è stato identificato come una via di segnalazione Wnt cruciale non canonica tra NCC e progenitori del secondo campo cardiaco (SHF). In conclusione, questo è un protocollo altamente trattabile per studiare i meccanismi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro.
Introduction
La segnalazione Wnt non canonica è una via evolutivamente conservata che regola l’organizzazione dei filamenti cellulari e la migrazione direzionale. Questa via è stata implicata in molteplici processi biologici, tra cui la morfogenesi del tessuto embrionale 1,2,3, l’angiogenesi linfatica e vascolare 4,5,6,7 e la crescita e le metastasi del cancro 8,9,10 . A livello cellulare, la segnalazione Wnt non canonica viene effettuata attraverso interazioni paracrine coordinate tra cellule che inviano e ricevono il segnale. Queste interazioni si verificano frequentemente tra cellule di diversi lignaggi o tipi e coinvolgono una rete molecolare diversificata che comprende fino a 19 ligandi e recettori multipli, co-recettori ed effettori di trasduzione del segnale a valle11. A complicare ulteriormente questo processo di segnalazione, studi precedenti hanno dimostrato che le combinazioni ligando-recettore possono variare in modo dipendente dal contesto e dal tessuto 12,13 e che gli stessi ligandi sorgente che guidano la segnalazione Wnt non canonica nelle cellule riceventi del segnale possono essere prodotti da più tipi di cellule che inviano segnale 14,15 . Data la complessità cellulare e molecolare associata al segnale Wnt non canonico, la capacità di studiare in vivo meccanismi individuali e clinicamente rilevanti è stata limitata.
Sono stati fatti tentativi per studiare la segnalazione Wnt non canonica utilizzando tecniche di coltura cellulare in vitro. Ad esempio, sono stati utilizzati saggi di guarigione delle ferite eseguiti in monostrati cellulari per valutare funzionalmente la migrazione direzionale cellulare 4,16,17,18,19. Le tecniche di immunocolorazione sono state utilizzate per eseguire analisi spaziali dell’espressione proteica di superficie per valutare i cambiamenti non canonici indotti da Wnt nella morfologia cellulare 7,10, nell’architettura e nella polarizzazione asimmetrica18,19,20. Sebbene questi approcci abbiano fornito importanti strumenti per caratterizzare i fenotipi correlati a Wnt nelle cellule che ricevono il segnale, la mancanza di componenti di invio del segnale in questi protocolli limita la loro capacità di modellare accuratamente i meccanismi di segnalazione paracrina osservati in vivo. Di conseguenza, rimane una necessità critica di sviluppare sistemi in vitro che consentano una valutazione robusta e riproducibile delle interazioni di segnalazione paracrina tra le cellule mittenti e riceventi del segnale della via Wnt non canonica, in particolare quelle di diversi tipi cellulari.
A tal fine, l’obiettivo primario di questo studio è stato quello di stabilire un protocollo per modellare le interazioni di segnalazione Wnt paracrine non canoniche in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema di cocoltura senza contatto che ricapitola le componenti di invio e ricezione del segnale di queste interazioni e consente l’uso di approcci molecolari, genetici o farmacologici standard per studiare in modo indipendente specifici meccanismi ligando-recettore nel percorso Wnt non canonico. I meccanismi di segnalazione Wnt mediata da NCC sono stati esaminati nei mioblasti utilizzando linee cellulari murine stabilite. Come prova di principio, questo modello è stato utilizzato per corroborare i risultati di precedenti studi in vivo nei topi che implicano l’asse Wnt5a-ROR2 come una via di segnalazione Wnt non canonica rilevante tra NCC 21 e progenitori dei cardiomioblasti SHF 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La via di segnalazione non canonica Wnt/polarità cellulare planare (PCP) è una via di segnalazione cellulare di importanza critica che è stata implicata nei processi di sviluppo multiplo 24,25 e malattia24,26. Durante lo sviluppo embrionale, la segnalazione Wnt non canonica coinvolge una vasta rete di segnali molecolari provenienti da cellule che inviano segnali che alla fine inducono cambiame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F30HL154324 a O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 a S.R.K. Gli autori desiderano riconoscere che lo schema nella Figura 1 di questo manoscritto è stato creato con biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
