יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית
Summary
כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.
Abstract
המחקר של גליקוסילציה אצל פרוקריוטים הוא אזור שגדל במהירות. על פני השטח שלהם יש לחיידקים מבנים גליקוסיליים שונים, שהגליקנים שלהם מהווים ברקוד ספציפי לזן. הגליקנים הקשורים אליהם מראים גיוון גבוה יותר בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לאלה של אאוקריוטים, והם חשובים בתהליכי זיהוי חיידקים-מארחים ובאינטראקציה עם הסביבה. בחיידקים פתוגניים, גליקופרוטאינים היו מעורבים בשלבים שונים של תהליך הזיהום, ושינויי גליקאן יכולים להפריע לתפקודים ספציפיים של גליקופרוטאינים. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה בהבנת ההרכב, המבנה ומסלולי הביוסינתזה של הגליקנים, הבנת תפקידם של גליקופרוטאינים בפתוגניות או באינטראקציה עם הסביבה נותרה מוגבלת מאוד. יתר על כן, בחיידקים מסוימים, האנזימים הדרושים לגליקוזילציה של חלבונים משותפים עם מסלולים ביוסינטטיים אחרים של פוליסכרידים, כגון ליפופוליסכריד ומסלולים ביוסינטטיים כמוסות. החשיבות התפקודית של גליקוסילציה הובהרה במספר חיידקים באמצעות מוטציה של גנים ספציפיים שנחשבו מעורבים בתהליך הגליקוזילציה וחקר השפעתה על הביטוי של גליקופרוטאין המטרה והגליקן המשתנה. לאירומונס מזופילי יש פלגלום קוטבי יחיד ו-O-גליקוזילי. גליקנים פלאגלארים מראים גיוון בהרכב הפחמימות ובאורך השרשרת בין זני אירומונס . עם זאת, כל הזנים שנותחו עד כה מראים נגזרת של חומצה פסאודמינית כסוכר המקשר המשנה שאריות סרין או תראונין. נגזרת החומצה הפסאודמינית נדרשת להרכבת פלגלה קוטבית, ולאובדן שלה יש השפעה על הידבקות, היווצרות ביופילם והתיישבות. הפרוטוקול המפורט במאמר זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בבניית מוטנטים ריקים כדי להבין את המעורבות של גנים או אזורי גנום המכילים גליקוזילטרנספראזות פוטטיביות בביוסינתזה של גליקאן פלאגלאר. זה כולל את הפוטנציאל להבין את תפקודם של הגליקוזילטרנספראזות המעורבות ואת תפקידו של הגליקן. זה יושג על ידי השוואת המוטציה חסרת הגליקן לזן מסוג בר.
Introduction
גליקוזילציה של חלבונים תוארה הן בחיידקים גראם-חיוביים והן בחיידקים גראם-שליליים והיא מורכבת מהצמדה קוולנטית של גליקאן לשרשרת צד של חומצת אמינו 1,2. אצל פרוקריוטים, תהליך זה מתרחש בדרך כלל באמצעות שני מנגנונים אנזימטיים עיקריים: O- ו– N-glycosylation 3. ב-O-glycosylation, הגליקן מחובר לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות סרין (Ser) או תראונין (Thr). ב-N-גליקוזילציה, הגליקן מחובר לשרשרת הצדדית של חנקן אמיד של שאריות אספרגין (Asn) בתוך רצפי הטריפפטידים Asn-X-Ser/Thr, כאשר X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין.
גליקנים יכולים לאמץ מבנים ליניאריים או מסועפים והם מורכבים מחד-סוכרים או מפוליסכרידים המקושרים באופן קוולנטי על ידי קשרים גליקוזידיים. אצל פרוקריוטים, גליקנים בדרך כלל מראים גיוון בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לגליקנים אאוקריוטים4. יתר על כן, תוארו שני מסלולי גליקוזילציה חיידקיים שונים הנבדלים זה מזה באופן שבו הגליקן מורכב ומועבר לחלבון המקבל: גליקוזילציה רציפה ו-en bloc 5,6. עבור גליקוזילציה רציפה, הגליקן המורכב בנוי ישירות על החלבון על ידי תוספת רצופה של חד-סוכרים. ב-en bloc glycosylation, גליקאן שהורכב מראש מועבר לחלבון מאוליגוזכריד המקושר בשומנים על ידי אוליגוסכריל-טרנספראז (OTase) מיוחד. שני המסלולים הוכחו כמעורבים בתהליכי N ו-O-glycosylation 7.
לגליקוזילציה של חלבונים יש תפקיד בוויסות התכונות הפיזיקוכימיות והביולוגיות של חלבונים. נוכחותו של גליקאן יכולה להשפיע על האופן שבו החלבון מתקשר עם הליגנד שלו, מה שמשפיע על הפעילות הביולוגית של החלבון, אך יכול גם להשפיע על יציבות החלבון, המסיסות, הרגישות לפרוטאוליזה, אימונוגניות ואינטראקציות בין חיידקים לפונדקאים 8,9. עם זאת, מספר פרמטרים של גליקוזילציה, כגון מספר הגליקנים, הרכב הגליקן, המיקום ומנגנון ההתקשרות, עשויים גם הם להשפיע על תפקוד ומבנה החלבון.
גליקוסילטרנספראזות (GTs) הם האנזימים המרכזיים בביוסינתזה של גליקנים וגליקו-קונג’וגטים מורכבים. אנזימים אלה מזרזים את היווצרות הקשר הגליקוזידי בין מוטי סוכר ממולקולת תורם פעילה לבין מקבל מצע מסוים. GTs יכולים להשתמש הן בנוקלאוטידים והן בנון-נוקלאוטידים כמולקולות תורמות ולמקד מקבלי מצעים שונים, כגון חלבונים, סכרידים, חומצות גרעין וליפידים10. לכן, הבנת ה-GTs ברמה המולקולרית חשובה כדי לזהות את מנגנוני הפעולה והספציפיות שלהם, וגם מאפשרת להבין כיצד הרכב הסוכר של הגליקנים שמשנים מולקולות רלוונטיות קשור לפתוגניות. מסד הנתונים של האנזים הפעיל בפחמימות (CAZy)11 מסווג GTs על פי הומולוגיה של הרצף שלהם, המספקת כלי חיזוי שכן, ברוב משפחות GT, הקפל המבני ומנגנוני הפעולה הם אינווריאנטים. עם זאת, ארבע סיבות מקשות על חיזוי ספציפיות המצע של GTs רבים: 1) לא נקבע מוטיב רצף ברור הקובע את ספציפיות המצע בפרוקריוטים12, 2) GTs ו- OTases רבים מראים הפקרות מצע13,14, 3) GTs פונקציונליים קשה לייצר בתפוקה גבוהה בצורה רקומביננטית ו -4) הזיהוי של מצעי התורם והמקבלים הוא מורכב. למרות זאת, מחקרי מוטגנזה שנערכו לאחרונה אפשרו להשיג התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים הקטליטיים ולחסר את הקשירה של GTs.
בחיידקים, נראה כי O-גליקוזילציה שכיחה יותר מאשר N-גליקוזילציה. אתרי ה-O-glycosylation אינם מראים רצף קונצנזוס, ורבים מחלבוני ה-O-glycosylated מופרשים או חלבונים על פני התא, כגון פלאגלינים, פילי או אוטו-טרנספורטרים1. הגליקוזילציה של פלאגלין מראה שונות במספר האתרים המקבלים, בהרכב הגליקן ובמבנה. לדוגמה, ל-Burkholderia spp flagellins יש רק אתר מקבל אחד, בעוד שבקמפילובקטר ג’ג’וני, לפלגלנים יש לא פחות מ-19 אתרים מקבלים15,16. יתר על כן, עבור חלק מהחיידקים, הגליקן הוא חד-סוכר יחיד, בעוד שחיידקים אחרים הם בעלי גליקנים הטרוגניים הטרוגניים שנפגעו מחד-סוכרים שונים ויוצרים אוליגוסכרידים. ההטרוגניות הזו מתרחשת אפילו בקרב זנים מאותו המין. הליקובקטר פלאגלינים משתנים רק על ידי חומצה פסאודאמינית (PseAc)17, וניתן לשנות את קמפילובקטר פלאגלינים על ידי PseAc, צורת האצטאמידינו של החומצה הפסאודמינית (PseAm) או חומצה לגיונאמינית (LegAm), וגליקנים המופקים מסוכרים אלה עם אצטיל, N-אצטילגלוקוסאמין, או תחליפים פרופיוניים 18,19. ב-Aeromonas, פלאגלינים משתנים על ידי גליקנים שהרכבם נע בין נגזרת אחת של חומצת PseAc להטרופוליסכריד20, והחיבור של גליקנים למונומרים של פלגלין הוא תמיד באמצעות נגזרת PseAc.
באופן כללי, גליקוזילציה של פלאגלינים חיונית להרכבת חוטים, תנועתיות, אלימות וספציפיות מארח. עם זאת, בעוד דגלונים של C. jejuni16, H. pylori17, ו – Aeromonas sp. 21 לא יכול להרכיב לתוך נימה אלא אם כן מונומרים חלבון הם glycosylated, Pseudomonas spp. ו Burkholderia spp. 15 אינם דורשים גליקוסילציה להרכבת פלגלה. יתר על כן, בחלק מזני C. jejuni , שינויים בהרכב הסוכר של הגליקן פלאגלה משפיעים על האינטראקציה בין חיידק לפונדקאי ועשויים למלא תפקיד בהתחמקות מתגובות חיסוניות מסוימות16. Autoagglutination הוא מאפיין פנוטיפי נוסף המושפע משינויים בהרכב של גליקנים הקשורים flagellins. אוטו-אגלוטינציה נמוכה יותר מובילה להפחתה ביכולת ליצור מיקרוקולוניות וביופילם22. בחיידקים מסוימים, היכולת של פלגלה לעורר תגובה פרו-דלקתית נקשרה לגליקוזילציה של פלגלין. לכן, ב P. aeruginosa, גליקוזילציה flagellin משרה תגובה פרו דלקתית גבוהה יותר מאשר unglycosylated23.
אירומונס הם חיידקים גראם-שליליים הנמצאים בכל מקום בסביבה, מה שמאפשר להם להיות בממשק של כל רכיבי One Health 24. לאירומונים מזופיליים יש פלאגלום קוטבי יחיד, המיוצר באופן מכונן. יותר ממחצית המבודדים הקליניים מבטאים גם פלאגלין לרוחב, בלתי ניתן להשראה במדיה או צלחות צמיגות גבוהה. מחקרים שונים קישרו בין שני סוגי הפלגלה לבין השלבים המוקדמים של פתוגנזה חיידקית25. בעוד שפלגלינים קוטביים שדווחו עד כה הם O-גליקוזיליים ב-5-8 Ser או Thr שאריות של התחומים האימונוגניים המרכזיים שלו, פלאגלינים לרוחב אינם O-גליקוזיליים בכל הזנים. אף על פי שהגליקנים של פלגלה קוטבית מזנים שונים מראים גיוון בהרכב הפחמימות שלהם ובאורך השרשרתשלהם 20, הסוכר המקשר הוכח כנגזרת של חומצה פסאודמינית.
מטרתו של כתב יד זה היא לתאר שיטה להשגת מוטציות ריקות ב-GTs או באזורים כרומוזומליים ספציפיים המכילים GTs כדי לנתח את מעורבותם בביוסינתזה של פוליסכרידים רלוונטיים ובפתוגניות חיידקית, כמו גם את תפקידו של הגליקן עצמו. כדוגמה, אנו מזהים ומוחקים אזור כרומוזומלי המכיל GTs של אירומונס כדי לבסס את מעורבותו בגליקוזילציה של פלאגלין קוטבי ולנתח את תפקידו של הגליקן פלאגלין. אנו מראים כיצד למחוק GT מסוים כדי לבסס את תפקודו בביוסינתזה של גליקאן זה ואת תפקידו של גליקאן שונה. למרות השימוש ב- Aeromonas כדוגמה, ניתן להשתמש בעיקרון כדי לזהות ולחקור איי גליקוזילציה של פלגלה של חיידקים גראם שליליים אחרים ולנתח את תפקודם של GTs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים אחרים כגון O-אנטיגן ליפופוליסכריד.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב המוקדם הקריטי של שיטה זו הוא זיהוי של אזורים המעורבים בגליקוסילציה של פלגלה ו-GTs פוטטיביים מכיוון שאנזימים אלה מראים הומולוגיה גבוהה ומעורבים בתהליכים רבים. ניתוח ביואינפורמטי של גנומים של אירומונס במאגרי מידע ציבוריים מראה כי אזור זה צמוד לאזור הדגלה הקוטבי 2, המכיל את הגנים פל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר הלאומית של קנדה, עבור תוכנית Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, ספרד) ועבור הגנרליטאט דה קטלוניה (מרכז ההתייחסות לביוטכנולוגיה).
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O’Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
