細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

タンパク質グリコシル化は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方において記載されており、アミノ酸側鎖^1,2へのグリカンの共有結合からなる。原核生物では、このプロセスは、通常、2つの主要な酵素機構を介して起こる:O−およびN−グリコシル化³。O-グリコシル化において、グリカンはセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)残基のヒドロキシル基に結合している。N-グリコシル化において、グリカンはトリペプチド配列Asn-X-Ser/Thr内のアスパラギン(Asn)残基の側鎖アミド窒素に結合し、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。

グリカンは、直鎖状または分枝鎖状の構造を採用することができ、グリコシド結合によって共有結合で結合された単糖または多糖類から構成される。原核生物において、グリカンは通常、真核生物グリカン⁴と比較して糖組成および構造において多様性を示す。さらに、グリカンが組み立てられ、アクセプタータンパク質に移される方法において異なる2つの異なる細菌グリコシル化経路が記載されている:逐次的および 一括 グリコシル化^5、6。逐次グリコシル化の場合、複合糖鎖は、単糖の連続的な付加によってタンパク質上に直接構築される。 エンブロック グリコシル化では、予め組み立てられたグリカンが、特殊なオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)によって脂質結合オリゴ糖からタンパク質に転移される。両方の経路が 、N− および O−グリコシル化プロセスに関与することが示されている⁷。

タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の物理化学的および生物学的特性を調節する役割を有する。グリカンの存在は、タンパク質がそのリガンドとどのように相互作用するかに影響を与える可能性があり、これはタンパク質の生物学的活性に影響を与えるが、タンパク質の安定性、溶解性、タンパク質分解に対する感受性、免疫原性、および微生物と宿主の相互作用にも影響し得る^8,9。しかし、グリカンの数、グリカン組成、位置、および結合機構などのいくつかのグリコシル化パラメータも、タンパク質の機能および構造に影響を及ぼす可能性がある。

糖転移酵素(GT)は、複合グリカンおよび複合糖質の生合成における重要な酵素である。これらの酵素は、活性化されたドナー分子からの糖部分と特定の基質アクセプターとの間のグリコシド結合形成を触媒する。GTsは、ドナー分子としてヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの両方を使用し、タンパク質、糖類、核酸、および脂質などの異なる基質アクセプターを標的とすることができる¹⁰。したがって、GTを分子レベルで理解することは、その作用機序や特異性を解明するために重要であり、また、関連する分子を修飾する糖鎖の糖組成が病原性にどのように関連しているかを理解することを可能にする。炭水化物活性酵素データベース(CAZy)¹¹は、GTを配列相同性に従って分類し、ほとんどのGTファミリーにおいて構造的フォールドおよび作用機序が不変であるため、予測ツールを提供する。しかしながら、多くのGTの基質特異性を予測することが困難な理由は、1)原核生物において基質特異性を決定する明確な配列モチーフが決定されていない、¹²)多くのGTおよびOTaseが基質混交性を示す¹³、^14、3)機能的GTsが組換え形態で高収率で生産することが困難である、および4)ドナーおよびアクセプター基質の両方の同定が複雑である。それにもかかわらず、最近の突然変異誘発研究は、触媒機構の理解において著しい進歩を得て、GTの結合を差し引くことを可能にした。

細菌では、O-グリコシル化はN-グリコシル化よりも一般的であるようである。O-グリコシル化部位はコンセンサス配列を示さず、O–グリコシル化タンパク質の多くは、フラジェリン、ピリ、または自己輸送体などの分泌タンパク質または細胞表面タンパク質¹である。クラジェリングリコシル化は、アクセプター部位の数、グリカン組成、および構造に変動性を示す。例えば、バークホルデリア属の鞭毛虫は1つのアクセプター部位しか持たないが、カンピロバクター・ジェジュニでは、鞭毛虫は19のアクセプター部位^15,16個しか持た^ない。さらに、いくつかの細菌にとって、グリカンは単一の単糖であり、他の細菌はオリゴ糖を形成するために異なる単糖の妥協した不均一なグリカンを有する。この異原性は、同じ種の株間でも生じる。ヘリコバクター鞭毛虫はプセウダミン酸(PseAc)¹⁷によってのみ修飾され、カンピロバクター鞭毛虫はPseAc、プセウダミン酸(PseAm)またはレジオナミン酸(LegAm)のアセトアミジノ型、およびアセチル、N-アセチルグルコサミン、またはプロピオン置換^18,19を有するこれらの糖に由来するグリカンによって修飾することができる。アエロモナスでは、鞭毛虫は、その組成が単一のPseAc酸誘導体からヘテロ多糖²⁰までの範囲のグリカンによって修飾され、フラジェリンモノマーへのグリカンの結合は常にPseAc誘導体を介して行われる。

一般に、鞭毛虫のグリコシル化は、鞭毛フィラメントアセンブリ、運動性、ビルレンス、および宿主特異性に不可欠である。しかし、 C. jejuni¹⁶、 H. pylori^17、 および Aeromonas sp.^21は 、タンパク質モノマーがグリコシル化されない限り、フィラメントに組み立てることができない、 シュードモナス 属および バークホルデリア属。^15は 鞭毛集合のためにグリコシル化を必要としない。さらに、いくつかの C. jejuni 株では、鞭毛グリカンの糖組成の変化が細菌−宿主相互作用に影響を及ぼし、特定の免疫応答を回避する上で役割を果たし得る¹⁶。自己凝集は、フラジェリンに関連するグリカンの組成における修飾によって影響を受ける別の表現型特性である。より低い自己凝集は、マイクロコロニーおよびバイオフィルム²²を形成する能力の低下をもたらす。いくつかの細菌において、炎症促進反応を誘発する鞭毛の能力は、鞭毛グリコシル化と関連していた。したがって、 緑膿菌において、グリコシル化フラジェリンは、非グリコシル化²³よりも高い炎症誘発性応答を誘導する。

アエロモナは、環境中に遍在するグラム陰性菌であり、これにより、それらがすべてのOne Health成分²⁴の界面に存在することを可能にする。中温性アエロモナスは、恒常的に産生される単一の極性鞭毛を有する。臨床分離株の半分以上はまた、高粘度媒体またはプレート中で誘導可能な側方鞭毛を発現する。異なる研究は、両方の鞭毛タイプを細菌病因の初期段階と関連付けている²⁵。現在までに報告された極性鞭毛は、その中心免疫原性ドメインの5〜8 SerまたはThr残基でO-グリコシル化されているが、側方鞭毛はすべての株においてO-グリコシル化されていない。異なる株由来の極性鞭毛グリカンはそれらの糖鎖組成および鎖長²⁰において多様性を示すが、連結糖はプセウダミン酸誘導体であることが示された。

この原稿の目的は、GTを含む特定のGTまたは染色体領域におけるヌル変異体を取得し、関連する多糖類の生合成および細菌病原性におけるそれらの関与、ならびにグリカン自体の役割を分析する方法を説明することである。一例として、 アエロモナスの GTを含む染色体領域を同定・除去し、極性フラジェリングリコシル化への関与を確立し、フラジェリングリカンの役割を解析します。我々は、このグリカンの生合成におけるその機能を確立するために特定のGTを削除する方法と修飾グリカンの役割を示す。 アエロモナス を例にとりますが、この原理は、他のグラム陰性菌の鞭毛グリコシル化島を同定して研究し、O抗原リポ多糖などの他のグリカンの生合成に関与するGTの機能を分析するために使用できます。