Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Die Proteinglykosylierung wurde sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gram-negativen Bakterien beschrieben und besteht aus der kovalenten Bindung eines Glykans an eine Aminosäure-Seitenkette ^1,2. In Prokaryoten geschieht dieser Prozess normalerweise über zwei wichtige enzymatische Mechanismen: O- und N-Glykosylierung ³. Bei der O-Glykosylierung wird das Glykan an die Hydroxylgruppe eines Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Rückstands gebunden. Bei der N-Glykosylierung ist das Glykan an den Seitenkettenamidstickstoff eines Asparagins (Asn)-Rests innerhalb der Tripeptidsequenzen Asn-X-Ser/Thr gebunden, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein könnte.

Glykane können lineare oder verzweigte Strukturen annehmen und bestehen aus Monosacchariden oder Polysacchariden, die kovalent durch glykosidische Bindungen verbunden sind. In Prokaryoten zeigen Glykane im Vergleich zu eukaryotischen Glykanen in der Regel eine Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur⁴. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene bakterielle Glykosylierungswege beschrieben, die sich darin unterscheiden, wie das Glykan zusammengesetzt und auf das Akzeptorprotein übertragen wird: sequentielle und en-bloc-Glykosylierung ^5,6. Für die sequentielle Glykosylierung wird das komplexe Glykan durch sukzessive Zugabe von Monosacchariden direkt auf dem Protein aufgebaut. Bei der en-bloc-Glykosylierung wird ein vormontiertes Glykan von einem lipidgebundenen Oligosaccharid durch eine spezialisierte Oligosaccharyltransferase (OTase) auf das Protein übertragen. Es wurde gezeigt, dass beide Signalwege an N- und O-Glykosylierungsprozessen beteiligt sind⁷.

Die Proteinglykosylierung spielt eine Rolle bei der Modulation der physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften von Proteinen. Das Vorhandensein eines Glykans kann beeinflussen, wie das Protein mit seinem Liganden interagiert, was sich auf die biologische Aktivität des Proteins auswirkt, aber auch die Proteinstabilität, Löslichkeit, Anfälligkeit für Proteolyse, Immunogenität und Mikroben-Wirt-Interaktionen^{beeinflussen kann 8,9}. Mehrere Glykosylierungsparameter, wie die Anzahl der Glykane, die Zusammensetzung des Glykans, die Position und der Bindungsmechanismus, könnten jedoch auch die Proteinfunktion und -struktur beeinflussen.

Glykosyltransferasen (GTs) sind die Schlüsselenzyme bei der Biosynthese komplexer Glykane und Glykokonjugate. Diese Enzyme katalysieren die glykosidische Bindungsbildung zwischen einem Zuckeranteil aus einem aktivierten Donormolekül und einem spezifischen Substratakzeptor. GTs können sowohl Nukleotide als auch Nicht-Nukleotide als Donormoleküle verwenden und auf verschiedene Substratakzeptoren wie Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und Lipide^{abzielen 10}. Daher ist das Verständnis von GTs auf molekularer Ebene wichtig, um ihre Wirkmechanismen und Spezifität zu identifizieren, und ermöglicht auch das Verständnis, wie die Zuckerzusammensetzung von Glykanen, die relevante Moleküle modifizieren, mit der Pathogenität zusammenhängt. Die Carbohydrate Active Enzymdatenbank (^CAZy)11 klassifiziert GTs nach ihrer Sequenzhomologie, was ein prädiktives Werkzeug darstellt, da in den meisten GT-Familien die strukturelle Falte und die Wirkmechanismen invariant sind. Vier Gründe machen es jedoch schwierig, die Substratspezifität vieler GTs vorherzusagen: 1) In Prokaryoten wurde kein klares Sequenzmotiv bestimmt, das die Substratspezifität bestimmt 12, 2) viele GTs und OTasen zeigen Substratpromiskuität^13,14, 3) funktionelle GTs sind in rekombinanter Form schwer in hoher Ausbeute herzustellen und 4) die Identifizierung von Donor- und Akzeptorsubstraten ist komplex. Trotzdem haben neuere Mutagenesestudien es ermöglicht, signifikante Fortschritte im Verständnis katalytischer Mechanismen zu erzielen und die Bindung von GTs zu subtrahieren.

Bei Bakterien scheint die O-Glykosylierung häufiger anzutreffen als die N-Glykosylierung. Die O-Glykosylierungsstellen zeigen keine Konsenssequenz, und viele der O-glykosylierten Proteine sind sezernierte oder zelloberflächennahe Proteine, wie Flagelline, Pili oder Autotransporter¹. Die Flagellinglykosylierung zeigt eine Variabilität in der Anzahl der Akzeptorstellen, der Glykanzusammensetzung und der Struktur. Zum Beispiel haben Burkholderia spp Flagelline nur eine Akzeptorstelle, während in Campylobacter jejuni Flagelline bis zu 19 Akzeptorstellen^15,16 haben. Darüber hinaus ist das Glykan für einige Bakterien ein einzelnes Monosaccharid, während andere Bakterien heterogene Glykane besitzen, die von verschiedenen Monosacchariden kompromittiert sind, um Oligosaccharide zu bilden. Diese Heterogenität tritt sogar bei Stämmen derselben Art auf. Helicobacter-Flagelline werden nur durch Psedaminsäure (PseAc)17 modifiziert, und Campylobacter-Flagellanine können durch PseAc, die Acetamidino-Form der Psedaminsäure (PseAm) oder Legionaminsäure (LegAm) und Glykane, die von diesen Zuckern abgeleitet sind, mit Acetyl, N-Acetylglucosamin oder Propionsubstitutionen^18,19 modifiziert werden. In Aeromonas werden Flagelline durch Glykane modifiziert, deren Zusammensetzung von einem einzelnen PseAc-Säurederivat bis zu einem Heteropolysaccharid²⁰ reicht, und die Bindung von Glykanen an die Flagellinmonomere erfolgt immer über ein PseAc-Derivat.

Im Allgemeinen ist die Glykosylierung von Flagellinen für die Flagella-Filament-Assemblierung, Motilität, Virulenz und Wirtsspezifität unerlässlich. Während jedoch Flagellins von C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 und} Aeromonas sp. ²¹ kann sich nicht zu Filament zusammensetzen, es sei denn, die Proteinmonomere sind glykosyliert, Pseudomonas spp. und Burkholderia spp. ¹⁵ erfordern keine Glykosylierung für die Flagellenmontage. Darüber hinaus beeinflussen bei einigen C. jejuni-Stämmen Veränderungen in der Zuckerzusammensetzung des Flagellenglykans die Bakterien-Wirt-Interaktion und können eine Rolle bei der Umgehung bestimmter Immunantworten^{spielen 16}. Autoagglutination ist ein weiteres phänotypisches Merkmal, das durch Modifikationen in der Zusammensetzung von Glykanen, die mit Flagellinen assoziiert sind, beeinflusst wird. Eine geringere Autoagglutination führt zu einer Verringerung der Fähigkeit, Mikrokolonien und Biofilm²² zu bilden. Bei einigen Bakterien war die Fähigkeit von Flagellen, eine entzündungsfördernde Reaktion auszulösen, mit der Flagellin-Glykosylierung verbunden. So induziert in P. aeruginosa glykosyliertes Flagellin eine höhere entzündungsfördernde Reaktion als unglykosyliertes²³.

Aeromonas sind gramnegative Bakterien, die in der Umwelt allgegenwärtig sind, wodurch sie sich an der Schnittstelle aller One Health-Komponenten ^{befinden können 24}. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes polares Flagellum, das konstitutiv produziert wird. Mehr als die Hälfte der klinischen Isolate exprimieren auch laterales Flakellin, induzierbar in hochviskosen Medien oder Platten. Verschiedene Studien haben beide Flagellentypen mit den frühen Stadien der bakteriellen Pathogenese in Verbindung gebracht²⁵. Während die bisher berichteten polaren Flagelline bei 5-8 Ser- oder Thr-Resten ihrer zentralen immunogenen Domänen O-glykosyliert sind, sind laterale Flagellaline nicht in allen Stämmen O-glykosyliert. Obwohl polare Flagellenglykane aus verschiedenen Stämmen eine Vielfalt in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge²⁰ aufweisen, hat sich gezeigt, dass der verbindende Zucker ein Pseudaminsäurederivat ist.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Gewinnung von Nullmutanten in spezifischen GTs oder chromosomalen Regionen, die GTs enthalten, zu beschreiben, um ihre Beteiligung an der Biosynthese relevanter Polysaccharide und an der bakteriellen Pathogenität sowie die Rolle des Glykans selbst zu analysieren. Als Beispiel identifizieren und löschen wir eine chromosomale Region, die GTs von Aeromonas enthält, um ihre Beteiligung an der polaren Flagellin-Glykosylierung festzustellen und die Rolle des Flagellin-Glykans zu analysieren. Wir zeigen, wie man ein spezifisches GT löscht, um seine Funktion bei der Biosynthese dieses Glykans und die Rolle des modifizierten Glykans zu bestimmen. Obwohl Aeromonas als Beispiel verwendet wird, kann das Prinzip verwendet werden, um Flagellenglykosylierungsinseln anderer gramnegativer Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen und die Funktion von GTs zu analysieren, die an der Biosynthese anderer Glykane wie dem O-Antigen-Lipopolysaccharid beteiligt sind.