Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

La glicosilación proteica se ha descrito tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas y consiste en la unión covalente de un glicano a una cadena lateral^{de aminoácidos 1,2}. En los procariotas, este proceso generalmente ocurre a través de dos mecanismos enzimáticos principales: O- y N-glicosilación ³. En la O-glicosilación, el glicano se une al grupo hidroxilo de un residuo de serina (Ser) o treonina (Thr). En la N-glicosilación, el glicano se une a la cadena lateral de nitrógeno amida de un residuo de asparagina (Asn) dentro de las secuencias de tripéptidos Asn-X-Ser/Thr, donde X podría ser cualquier aminoácido excepto prolina.

Los glicanos pueden adoptar estructuras lineales o ramificadas y están compuestos de monosacáridos o polisacáridos unidos covalentemente por enlaces glicosídicos. En los procariotas, los glicanos suelen mostrar diversidad en la composición y estructura del azúcar en comparación con los glicanos eucariotas⁴. Además, se han descrito dos vías de glicosilación bacteriana diferentes que difieren en la forma en que el glicano se ensambla y se transfiere a la proteína aceptora: glicosilación secuencial y en bloque ^5,6. Para la glicosilación secuencial, el complejo glicano se acumula directamente sobre la proteína mediante la adición sucesiva de monosacáridos. En la glicosilación en bloque, un glicano preensamblado se transfiere a la proteína desde un oligosacárido ligado a lípidos por una oligosacarilasa especializada (OTasa). Se ha demostrado que ambas vías están involucradas en los procesos de glicosilación N y O ⁷.

La glicosilación de proteínas tiene un papel en la modulación de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas. La presencia de un glicano puede influir en cómo la proteína interactúa con su ligando, lo que afecta la actividad biológica de la proteína, pero también puede afectar la estabilidad de la proteína, la solubilidad, la susceptibilidad a la proteólisis, la inmunogenicidad y las interacciones microbio-huésped ^8,9. Sin embargo, varios parámetros de glicosilación, como el número de glicanos, la composición del glicano, la posición y el mecanismo de unión, también podrían afectar la función y la estructura de la proteína.

Las glicosiltransferasas (GT) son las enzimas clave en la biosíntesis de glicanos complejos y glicoconjugados. Estas enzimas catalizan la formación de enlaces glicosídicos entre una fracción de azúcar de una molécula donante activada y un aceptor de sustrato específico. Los GT pueden usar nucleótidos y no nucleótidos como moléculas donantes y dirigirse a diferentes aceptores de sustrato, como proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos y lípidos¹⁰. Por lo tanto, comprender los GT a nivel molecular es importante para identificar sus mecanismos de acción y especificidad, y también permite comprender cómo la composición de azúcar de los glicanos que modifican moléculas relevantes se relaciona con la patogenicidad. La carbohydrate Active enzyme database (CAZy)¹¹ clasifica los GT según su homología de secuencia, lo que proporciona una herramienta predictiva ya que, en la mayoría de las familias GT, el pliegue estructural y los mecanismos de acción son invariantes. Sin embargo, cuatro razones dificultan la predicción de la especificidad del sustrato de muchos GT: 1) no se ha determinado un motivo de secuencia claro que determine la especificidad del sustrato en procariotas¹², 2) muchos GT y OT muestran promiscuidad del sustrato^13,14, 3) los GT funcionales son difíciles de producir en alto rendimiento en forma recombinante y 4) la identificación de sustratos donantes y aceptores es compleja. A pesar de ello, recientes estudios de mutagénesis han permitido obtener avances significativos en la comprensión de los mecanismos catalíticos y restar la unión de los GT.

En las bacterias, la O-glicosilación parece ser más frecuente que la N-glicosilación. Los sitios de O-glicosilación no muestran una secuencia de consenso, y muchas de las proteínas O-glicosiladas son secretadas o proteínas de la superficie celular, como flagelinas, pili o autotransportadores¹. La glicosilación de flagelina muestra variabilidad en el número de sitios aceptores, la composición de glicanos y la estructura. Por ejemplo, Burkholderia spp flagellins tienen solo un sitio de aceptación, mientras que en Campylobacter jejuni, flagellins tienen hasta 19 sitios de aceptación^15,16. Además, para algunas bacterias, el glicano es un solo monosacárido, mientras que otras bacterias poseen glicanos heterogéneos comprometidos de diferentes monosacáridos para formar oligosacáridos. Esta heterogenicidad ocurre incluso entre cepas de la misma especie. Las flagelinas de Helicobacter solo son modificadas por el ácido pseudamínico (PseAc)¹⁷, y las flagelinas de Campylobacter pueden ser modificadas por PseAc, la forma acetamidino del ácido pseudaminic (PseAm) o ácido legionamínico (LegAm), y los glicanos derivados de estos azúcares con acetil, N-acetilglucosamina o sustituciones propiónicas^18,19. En Aeromonas, las flagelinas son modificadas por glicanos cuya composición varía desde un solo derivado ácido PseAc hasta un heteropolisacárido²⁰, y la unión de glicanos a los monómeros de flagelina es siempre a través de un derivado PseAc.

En general, la glicosilación de las flagelinas es esencial para el ensamblaje del filamento flagelar, la motilidad, la virulencia y la especificidad del huésped. Sin embargo, mientras que flagelinas de C. jejuni¹⁶, H. pylori^17, y Aeromonas sp. ²¹ no puede ensamblarse en filamento a menos que los monómeros de proteínas sean glicosilados, Pseudomonas spp. y Burkholderia spp. ¹⁵ no requieren glicosilación para el ensamblaje de flagelos. Además, en algunas cepas de C. jejuni , los cambios en la composición de azúcar del glicano flagelo afectan la interacción bacteriano-huésped y pueden desempeñar un papel en la evasión de ciertas respuestas inmunes¹⁶. La autoaglutinación es otra característica fenotípica afectada por modificaciones en la composición de los glicanos asociados con las flagelinas. Una menor autoaglutinación conduce a una reducción en la capacidad de formar microcolonias y^{biopelícula 22}. En algunas bacterias, la capacidad de los flagelos para desencadenar una respuesta proinflamatoria se relacionó con la glicosilación de flagelina. Así, en P. aeruginosa, la flagelina glicosilada induce una mayor respuesta proinflamatoria que la²³ no glicosilada.

Las aeromonas son bacterias Gram-negativas omnipresentes en el medio ambiente, lo que les permite estar en la interfaz de todos los componentes de One Health ²⁴. Las Aeromonas mesófilas tienen un solo flagelo polar, que se produce constitutivamente. Más de la mitad de los aislados clínicos también expresan flagelina lateral, inducible en medios o placas de alta viscosidad. Diferentes estudios han relacionado ambos tipos de flagelos con las primeras etapas de la patogénesis bacteriana²⁵. Mientras que las flagelinas polares reportadas hasta la fecha son O-glicosiladas a 5-8 Ser o Thr residuos de sus dominios inmunogénicos centrales, las flagelinas laterales no son O-glicosiladas en todas las cepas. Aunque los glicanos de flagelo polar de diferentes cepas muestran diversidad en su composición de carbohidratos y longitud^{de cadena 20}, se ha demostrado que el azúcar de enlace es un derivado del ácido pseudaminic.

El objetivo de este manuscrito es describir un método para obtener mutantes nulos en GTs específicos o regiones cromosómicas que contienen GT para analizar su participación en la biosíntesis de polisacáridos relevantes y en la patogenicidad bacteriana, así como el papel del propio glicano. Como ejemplo, identificamos y eliminamos una región cromosómica que contiene GT de Aeromonas para establecer su implicación en la glicosilación polar de flagelina y analizar el papel del glicano de flagelina. Mostramos cómo eliminar un GT específico para establecer su función en la biosíntesis de este glicano y el papel del glicano modificado. Aunque utilizando Aeromonas como ejemplo, el principio se puede utilizar para identificar y estudiar islas de glicosilación de flagelos de otras bacterias Gram-negativas y analizar la función de los GT implicados en la biosíntesis de otros glicanos como el lipopolisacárido del antígeno O.