ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

このプロトコルは、UW-Madisonの動物ケアガイドラインに従います。 1. PTBIの成人 ショウジョウバエ 生成 標準の十字架の場合は、20 バージン y[1] w[1]を配置します。UAS-mCD8-GFP;;OK107-GAL417成人女性と10 y[1]w[1]17成人男性は、食品を含むバイアル(材料表を参照)で一緒に飛びます。多数の同期子孫を使用するには、同時に 10 ~ 20 の十字を設定します。標準の十字は、遺伝子型のF1子孫を生じさせる: y[1] w[1];UAS-mCD8-GFP/+;;OK107-GAL4/+。 交配と産卵のために25°Cにバイアルを置きます。子孫を最大化するには、2〜4日ごとに新しいバイアルに両親を移し、以前のバイアルを25°Cで維持します。 両親が最初に入れられた18日後に各バイアルを捨て、F2の子孫がいないことを確認します。注:親の各セットから3セットの子孫(「broods」)を生成することができます。 F1の子孫が閉じ始める日から10日が経過したら、確認してください。 系統学的研究のために, 遺伝子型のF1パーマ双子の男性15 を使用してください: w;FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir;浴槽 -GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp.一貫性を保つには、毎回同じ方向に交差します。 パーマ双子の男性を生成するには, 場所 20 処女 w;FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir;浴槽-GAL80ts/TM6B女性および10のw;FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir;act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 成人男性は、食品を含むバイアルで一緒に. 交配と産卵のために17°Cにバイアルを置きます。両親を新しい食べ物のバイアルに7日ごとに移し、17°Cですべてのバイアルを維持します。 両親が最初に入れられた35日後に各バイアルを捨て、F2の子孫がいないことを確認します。 F1の子孫が閉じ始める日から21日後に確認してください。 2. 外傷性脳損傷の貫通 (PTBI; 図1) 新しく閉じた F1 フライを並べ替えます。6時間以内に若い男性を選択して、6時間の後のエローション。これらの男性は、バイアルあたり40以下のハエで、食べ物を含むきれいなバイアルに入れられます。注:これは、CO2 パッド上のハエを麻酔し、まだ腸内にメコニウム(腹壁を通して暗い緑色のスポットとして見える)を持つ成人男性を特定することによって、午前中に最も簡単に達成されます。 5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)を使用して前供給する( 材料表を参照)EdUで細胞を分割することを計画している場合、傷害の前に6時間。詳細については、ステップ 3 を参照してください。 70%エタノールを充填した1.5 mLマイクロ遠心分離管に100ピンを入れることにより、ミヌティエンピン( 材料表を参照)を5分間消毒します。 70%エタノールを噴霧し、清潔な糸くずのないティッシュで乾燥させてCO2 パッドとペイントブラシを消毒します。工具が清潔で乾燥したら、40人以下の並べ替えられたF1男性を清潔なパッドに戻します。 フライパッド上の2つのグループにF1の男性を分離します。1つのグループは、コントロール、怪我をしていないハエとして機能します。第2の実験群はPTBIに供される。 鉗子を使用して、マイクロ遠心分離管から4-5の新しいMinutienピンを引き出し、CO2 パッドの端の近くに置きます。解剖スコープの下で、鋭いポイントを持つまっすぐなミヌーティエンピンを選択してください。注: 実験に Minutien ピンを 1 本使用すると、変動性が減少します。鋭いピンを再利用します。70%エタノールを含む別の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに損傷または鈍いピンを入れ、安全に処分します。 標準の十字型のハエを使用する場合は、ステレオ顕微鏡の発光ダイオード(LED)ランプに、緑色蛍光タンパク質(GFP)用の適切な励起フィルタと発光フィルタを装備したスイッチをオンにします。これにより、440-460 nMで励起が可能となり、500-560 nMの可視化が可能になります。注:このランプとフィルタセットを使用すると、キノコ本体の細胞体が頭のキューティクルを通して緑色に蛍光を発します(図1C)。パーマツインハエや他の遺伝子型のハエの場合、ステレオ顕微鏡用の標準的な白色光照度器を使用して、キノコの身体に損傷を標的にするための頭部キューティクルのランドマークを視覚化することができます(図1C)。 鉗子を使用して、選択したMinutienピンを片手で拾い上げ(右利きの人のために、これは通常は右手です)、もう一方の(通常は左)手の絵筆を持ち上げてください。実験グループからハエを選択し、右にハエの頭を持つヘッドカプセルの後ろ図を持っているようなハエを配置します。胸郭の前部にブラシを置き、軽く押し下げてハエを安定させる。 頭の右側にあるキノコ本体の細胞体にミヌーティエンピンの先端を向け、ヘッドカプセルを貫通します。ランドマークを使用する場合は、オセリと眼の後縁の間の後頭のキューティクルをターゲットにします(図1)。 怪我をした後、ペイントブラシを使ってミヌーティエンピンから頭をそっと押し出します。 RNA-SeqまたはqRT-PCRに脳を使用する場合は、頭の左側に2度目の損傷を与えます。 実験グループ内のすべてのハエを傷つけるには、ステップ2.8~2.10を繰り返します。 すべてのハエが負傷したら、コントロールと負傷したハエを食品を含むラベル付きの別々のバイアルに入れられます。ハエが麻酔から回復し、その後の老化の間にハエが食物に巻き込まれるのを防ぐために、バイアルを水平に(すなわち、彼らの側面に)置きます。 標準のクロスハエを25°Cに置き、パーマツインハエを30°Cで老化します。 24時間を超えるハエの場合は、1~2日ごとに清潔な食べ物に入れられます。 3. EdU ラベリング 10 mM 5-エチニル-2’デオキシウリジン(EdU)の在庫をジメチルスルホキシド(DMSO)で準備します。これは-20°Cで12ヶ月まで貯えることができる。 50 μM EdU の 200 μL を 10% スクロースで準備します。PTBIの前に6時間のエドゥとのプレフィードフライ。 20μM EdUを10%スクロースに200 μL、23mmの丸いグレード3のフィルターペーパー( 材料表を参照)に空のバイアルに入れてください。 ハエをバイアルに入れる。その後、綿のプラグでバイアルを密封します。 25°Cで6時間、加湿インキュベーターにバイアルを水平に置きます。 ステップ 2.3-2.10 の説明に従って PTBI を実行します。 ハエをEdU含有バイアルに戻します。バイアルを綿栓で密封します。 25°Cの加湿インキュベーターでバイアルを水平に24時間横に置きます。以下に説明するいずれかの手順に従います(ステップ3.8.1-3.8.3)。 ステップ4で説明したように、固定剤、洗浄バッファー、およびブロッキングバッファーを使用して、アジドを使用して脳を解剖し、固定し、抗体染色前に行ったEdU検出反応を用いた。 ハエを新しいフィルターペーパーを含むクリーンバイアルに移し、50 μM EdUを10%スクロースに200 μLします。バイアルを25°Cインキュベーターに水平に置きます。ラベリングの間は 24 時間ごとに繰り返します。そして、抗体染色の前に行ったEdU検出反応を用いてアジ化のない緩衝液を用いてステップ4に記載したとおりの脳を解剖して固定する。 EdUでパルスチェイスラベルを使用するには、24時間ごとにエハを新しいフィルターペーパーを含むクリーンバイアルに、200 μLの50 μMを10%スクロースに移します。パルス期間の後(例えば、4日間)、ハエを標準的なショウジョウバエ食品を含むバイアルに移す。バイアルを25°Cインキュベーターに3日間置きます。そして、抗体染色の前に行ったEdU検出反応を用いてアジ化のない緩衝液を用いてステップ4に記載したとおりの脳を解剖して固定する。 4. 解剖、免疫検査、実装 100 μLの固定液を備えた1.5 mLマイクロ遠心分離管を準備します:PEM(100 mMピペラジンN、N’-ビス(2-エタンスルホン酸)[PIPES]、1 mM EGTA、1 mM MgSO4、pH 7.0 を参照)および氷上の場所に4%ホルムアルデヒドを使用します。注:1つの遺伝子型と状態の20の脳は、単一のチューブで処理することができます。 70%エタノールの1つの小さなプール(約100 μL)とリン酸緩衝生理食塩水の3つの小さなプール(PBS;K2HPO4の100 mM、NaClの140 mM、pH 7.0)を備えた解剖プレートを準備します。 70%エタノールで消毒されたCO2 パッド上で、10個のコントロールまたは実験的なハエを麻酔します。 メスを使用して各フライのトランクから頭を分離します。 70%エタノールで濡れたペイントブラシでヘッドを集め、解剖プレートのエタノールプールに2〜5分間ヘッドを置きます。注:これはわずかに脳を脱水し、彼らは頭のキューティクルから離れて解剖することが容易になります。 頭部をPBSの約100 μLプールに移し、脳を解剖し、各脳をPBSのクリーンな~100 μLプールに移動させます。2組のウォッチメーカーの鉗子を使用してヘッドキューティクルの後ろを開き、1組の鉗子でキューティクルを保持し、2番目の鉗子の閉じた先端を使用してキューティクルから脳をそっと詮索します。 切断された脳を、切断され、脳の侵入を可能にするためにbeveedされたプラスチックチップを備えたP200ピペットを使用して、固定溶液の100 μLを含むマイクロ遠心分離管に移します。 室温で20〜25分の固定。P200またはガラスピペットで慎重に取り外します。 1 mLの’PT'(PBSプラス0.1%トリトンX-100)で固定脳を4回洗浄し、各洗浄の間に数分間脳を落ち着かせる。注:脳が激しく落ち着かないと、まだ脂肪の体や気管が付いている可能性が高いです。 PBSの1 mLに0.1%トリトンX-100および2%ウシ血清アルブミン(PBT)のブロックサンプルを室温で〜1時間用いた。 ブロッキング溶液を取り除き、PBTで4°Cで一晩100μLの一次抗体溶液を含むサンプルをインキュベートします。本研究で使用される一次抗体は、ウサギの抗PH3(1:500)およびマウス抗ファシクリンII(1:20)である( 材料表参照)。 PTの1 mLでサンプルを5回洗浄し、脳が各洗浄の間に数分間落ち着くことを可能にする。 最終洗浄を取り除き、4°Cで一晩100μLの二次抗体溶液をインキュベートします。 ここで使用される二次抗体は、抗ウサギ568(1:400)および抗マウスCy5(1:100)です( 材料表参照)。 PTの1 mLでサンプルを5回洗浄し、脳が各洗浄の間に数分間落ち着くことを可能にする。最後の洗浄中に、4′,6-ディアミディノ-2-フェニリンドール、ジ塩酸塩(DAPI;10 μM溶液の1:100)を10分間加えて核を染色します。洗浄を取り外し、各チューブに50~100μLを残します。 各スライドの中央に1枚の自己接着補強ラベルを配置し、アンチフェードマウントメディアの50 μL液滴を各ラベルの中央に配置して、顕微鏡スライドを準備します( 材料表を参照)。補強ラベルは、スライドの少し上にカバースリップを保持し、取り付けられた脳が過度に平坦化するのを防ぎます。 慎重にカットとベベリングプラスチックチップを装備したP200を使用して、可能な限り少ない洗浄バッファーで準備スライドに各マイクロ遠心チューブから脳を転送します。1つのスライドに10の頭脳を取り付けることができます。 各スライドにカバースリップを配置し、マニキュアでスライドを密封する前に、フォースを使用して脳をそっと再配置します。後側を上または前側のどちらかを上にして脳を向けるが、互いに触れ合うべきではない。注:脳全体を通して高品質の共焦点画像を得ることは困難であるため、一部の脳は各方向に取り付ける必要があります。 準備スライドを平らにして、4°Cの暗闇の中でイメージングまで保管してください。長期保存(1年まで)の場合、スライドは-20°Cで保存することができます。 5. 共焦点イメージング 注:DAPIおよび蛍光二次抗体(すなわち、405 nm、488 nm、および568 nm、633nm)に適した励起レーザーおよび放出フィルターキューブを用いるレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いる画像脳。 顕微鏡、レーザー、コントローラー、コンピュータの電源を入れます。 取得ソフトウェアを開きます。 取得モードでは、最大 4 つのチャンネルを選択し、目的のチャンネルの順次スキャンのパラメータを設定します。各チャンネルのレーザーパワーを5~10%に上げます。 顕微鏡の上にスライドを置きます。 蛍光性付着を使用して画像化する脳を選択します( 材料表を参照)。 取得モードで、フレーム寸法として 1024 x 1024 ピクセルを選択します。 取得モードで Z-stack オプションを選択し、Z-stack を 2 μm のセクションで取り出す必要があることを示し、サンプルを通して焦点を合わせ、イメージする上と下の焦点面を選択します。 60xの目的を使用してキノコの体などの20xの目的と特定の脳領域を使用して、脳全体のZスタック画像を収集します。 6. データ分析 増殖する細胞とパーマツインクローンの数を手動で定量化するか、画像解析ソフトウェアを使用して数値を定量化します( 資料表を参照)。ソフトウェアを使用する場合は、10μm以上の領域を含む対象領域(ROI)を選択します。