Este artigo fornece protocolos detalhados para infligir Lesão Cerebral Traumática Penetrante (PTBI) à Drosophila adulta e examinar a neurogênese resultante.
Os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à neurogênese em resposta a doenças ou lesões não são bem compreendidos. No entanto, compreender esses mecanismos é crucial para o desenvolvimento de terapias regenerativas neurais. Drosophila melanogaster é um modelo líder para estudos de desenvolvimento neural, mas historicamente não tem sido explorado para investigar a regeneração cerebral adulta. Isso ocorre principalmente porque o cérebro adulto exibe atividade mitótica muito baixa. No entanto, a penetração da lesão cerebral traumática (PTBI) no cérebro central de Drosophila adulto desencadeia a geração de novos neurônios e nova glia. As poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila combinadas com o simples, mas rigoroso protocolo de lesão descrito aqui agora fazem do cérebro de Drosophila adulto um modelo robusto para a pesquisa de regeneração neural. Desde que aqui estão instruções detalhadas para (1) lesões penetrantes no cérebro central adulto e (2) dissecção, imunohistoquímica e imagem pós-lesão. Esses protocolos produzem resultados altamente reprodutíveis e facilitarão estudos adicionais para dissecar mecanismos subjacentes à regeneração neural.
Danos no cérebro e no sistema nervoso são uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo. Cerca de 1,5 milhão de americanos sofrem lesões cerebrais traumáticas (TCE) todos os anos1, enquanto estima-se que 6 milhões de indivíduos só nos Estados Unidos sofrem de doenças neurodegenerativas, como Parkinson e Doença de Alzheimer2. Tanto a doença quanto a lesão no cérebro podem causar degeneração neural, levando a defeitos sensoriais, cognitivos e motores3. Desenvolver estratégias terapêuticas para reparação cerebral humana tem sido difícil devido à complexa fisiologia do cérebro. Organismos modelo como o Drosophila melanogaster fornecem um sistema simples para identificar os mecanismos fundamentais subjacentes à neurodegeneração e potenciais alvos terapêuticos4.
A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster tem sido um poderoso organismo modelo por mais de um século, avançando nos campos da genética, biologia do desenvolvimento e neurociência5,6. O cérebro de Drosophila compreende apenas ~90.000 neurônios7, um milhão de vezes menos do que o cérebro humano médio8, mas eles têm muitas semelhanças. Tanto cérebros humanos quanto moscas utilizam os neurotransmissores GABA, glutamato, acetilcolina, e as aminas biogênicas dopamina e serotonina9. Drosophila e neurônios humanos também funcionam da mesma forma, com uma arquitetura sináptica compartilhada e tipos de células neurais análogas10. O menor tamanho cerebral de Drosophila e a disponibilidade de técnicas genéticas avançadas, em combinação com a conservação de mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos entre drosophila e mamíferos, permite que os pesquisadores de Drosophila façam perguntas impraticáveis ou difíceis de responder em modelos mamíferos.
Nosso entendimento atual da neurogênese adulta em Drosophila, tanto durante a homeostase quanto após a lesão, permanece limitado. Mais se sabe sobre neurogênese durante o desenvolvimento normal. Por exemplo, neurônios e glia são criados durante o desenvolvimento a partir de células precursoras, chamados neuroblastos10,11. Pelo menos três tipos diferentes de neuroblastos foram distinguidos no cérebro central. Tanto os neuroblastos de linhagem tipo I quanto tipo II saem do ciclo celular ~20-30 h após a formação do puparium12. Em contraste, os neuroblastos do corpo do cogumelo são os últimos a encerrar a divisão celular e fazê-lo através da apoptose dependente do Ceifador ~85-90 h após a formação do puparium13. Após a eclosão, o cérebro de Drosophila adulto tem poucas células divisórias (~1 célula/cérebro), predominantemente glia14. Os lobos ópticos adultos possuem neuroblastos de ciclismo lento capazes de neurogênese15, enquanto o cérebro central adulto não tem neuroblastos conhecidos. A escassez de progenitores neurais e a proliferação celular limitada se assemelha fortemente à situação no cérebro adulto dos mamíferos, ressaltando a relevância potencial dos mecanismos da neurogênese adulta em Drosophila para os seres humanos.
A descoberta de baixos níveis de neurogênese adulta nos lobos ópticos de Drosophila adultos após lesões15 levou à hipótese de que o cérebro central de Drosophila adulto também poderia ser capaz de neurogênese adulta16. Este protocolo descreve a criação de um modelo rigoroso e reprodutível de lesão cerebral central em Drosophila adulto que pode ser usado para investigar neurogênese no cérebro central adulto. Dadas as semelhanças entre a arquitetura e a função cerebral humana e drosophila , essas descobertas podem levar à identificação de alvos críticos para neurogênese terapêutica em cérebros humanos feridos e doentes.
Embora lesões penetrantes no cérebro adulto de Drosophila tenham sido descritas anteriormente15,17,18, essas lesões se concentraram nos lobos ópticos e não no cérebro central. Além disso, faltam instruções detalhadas de como realizar os ferimentos. Este protocolo descreve um modelo para lesão penetrante no cérebro central de Drosophila adulto que reproduz evidências estatisticamente significativas para neurogênese adulta após PTBI.
A reprodutibilidade deste protocolo ptbi deve-se, em parte, ao corpo do cogumelo como a região alvo da lesão. O corpo de cogumelo é grande, consistindo de ~2200 neurônios com dendrita complexa e arbors de axon em grandes e altamente estereotipadas matrizes18. Os corpos celulares dos neurônios do corpo dos cogumelos ficam perto da superfície do cérebro e podem ser visualizados através da cutícula da cabeça usando a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) (Figura 1C). Precursores do corpo de cogumelos são as últimas células-tronco neurais a se submeterem à apoptose durante o desenvolvimento13,12,19. Assim, muitos neurônios corporais de cogumelos são muito jovens na época da eclosão. Isso levou à hipótese de que o corpo de cogumelo pode ter mais potencial mitotístico do que outras regiões cerebrais16. Além disso, o corpo de cogumelo é fundamental para o aprendizado e memória18. Isso permite perguntar se a neurogênese desencadeada pelo PTBI leva à recuperação funcional.
Outros fatores que contribuem para a reprodutibilidade dos resultados incluem o uso de moscas ultrapassadas de genótipos consistentes, a realização de cruzes na mesma direção de cada vez, o controle preciso das temperaturas de criação e envelhecimento, e a análise de machos e fêmeas separadamente. O uso de moscas de F1 de um outcross reduz a probabilidade de analisar cérebros homozigos para mutações espontâneas. A cruz padrão de y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 fêmeas adultas para y[1] moscas machos adultas resulta em prole F1 do genótipo y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 é expresso em todos os neurônios intrínsecos do corpo do cogumelo e impulsiona a expressão do repórter uas-mCD8-GFP ligado à membrana permitindo a visualização de corpos de cogumelos e suas projeções. Para as cruzes perma-twin, as cruzes devem permanecer a 17 °C o tempo todo para manter o sistema de rastreamento de linhagem desligado. Isso garante que nenhuma célula divisória seja rotulada durante o desenvolvimento e que apenas neurônios e glia nascidos em adultos sejam rotulados. Para isso, a sala de voo também pode ser mantida a 17 °C. Embora a descrição inicial do sistema perma-twin15 recomendado para a criação voa a 18 °C, isso pode levar a uma rotulagem de fundo significativa.
Para consistência, também é recomendado manter o controle de moscas não feridas na almofada de CO2 enquanto se realiza o PTBI. Isso garante que ambos os conjuntos de moscas tenham exposição anestésico idêntica. Além disso, é desejável que a reprodutibilidade penetre completamente a cabeça. No entanto, deve-se tomar cuidado para não dobrar a ponta do pino contra a almofada, tornando-a inutilizável para lesões futuras. Para profissionais qualificados, há pouco dano não intencional às moscas do PTBI. No entanto, pressionar muito forte no tórax para estabilizar a mosca durante a lesão pode ser letal. Uma maneira de avaliar a extensão da lesão não intencional é quantificar a mortalidade de moscas de PTBI 24 h após a lesão. Para moscas com ferimentos unilaterais, isso pode ser 50% ou mais para iniciantes. Portanto, para garantir que os desfechos observados sejam devidos ao TCE e não à lesão não intencional, é aconselhável que iniciantes pratiquem a administração de PTBI em ~20 moscas diariamente ao longo de várias semanas e não analisem os cérebros resultantes até que a mortalidade de 24 horas seja consistentemente <10%.
Para quantificar a quantidade de proliferação estimulada pelo PTBI cerebral central, tanto a imunostaining anti-fosfohistone H3 (PH3) quanto a incorporação de 5-ethynyl-2′-deoxyuridina (EdU) podem ser empregadas. Anti-PH3 rotula células antes e ao longo da metafase, limitando a detecção a apenas uma fração das células que dividem ativamente. Assim, a coloração anti-PH3 proporciona apenas um vislumbre parcial da proliferação. EdU é um analógico de timmidina que pode ser incorporado em DNA recém-sintetizado. Alimentando moscas EdU antes e depois da lesão, é possível obter uma imagem mais completa das células que estão se dividindo ou se dividiram após a lesão. O fato de que todas as células que se dividem são permanentemente marcadas é útil tanto para a identificação de células de ciclismo lentas quanto para avaliar a sobrevivência das células após a proliferação inicial. Por razões pouco claras, mas talvez devido à permeabilidade limitada da barreira hematoencefálica, a rotulagem da EdU é ineficiente e subestima a proliferação celular no cérebro adulto. Isso é evidenciado pelos números semelhantes de células PH3+ e EdU+ em cérebros de controle e experimentais a 24 h pós-PTBI e observando que apenas um subconjunto de novas células em clones perma-twin incorporam EdU16. Para rotulagem máxima, é essencial pré-alimentar as moscas com EdU porque moscas feridas não retomam a alimentação por várias horas após o PTBI. A alimentação foi avaliada adicionando coloração alimentar à solução EdU e monitorando a quantidade de corante no intestino através da cutícula abdominal16.
Deve-se notar que, embora tenhamos fornecido um protocolo de dissecção cerebral na etapa 4, técnicas alternativas podem ser usadas. Vários deles estão disponíveis em protocolos publicados anteriormente20,21,22. Drosophila melanogaster oferece um modelo de baixo custo com poderosas ferramentas genéticas e moleculares que podem ser usadas para estudar os mecanismos subjacentes à regeneração de múltiplos tecidos, incluindo o intestino e componentes do sistema nervoso. Um modelo de lesão novo e reprodutível que pode ser usado para estudar a resposta à lesão cerebral é descrito aqui. Dados obtidos por esses protocolos apoiam a ideia de que o cérebro central de Drosophila adulto retém a capacidade de proliferação, gerando novos neurônios em resposta à lesão. Essas observações justificam uma investigação mais aprofundada tanto da extensão da neurogênese adulta quanto de seus mecanismos moleculares subjacentes. Uma vez que os componentes envolvidos na regeneração neural são identificados neste sistema, podemos converter nosso conhecimento da neurogênese de Drosophila adulta em humanos.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a Stacey Rimkus e Becky Katzenberger por assistência técnica e a Eduardo Moreno por compartilhar as ações perma-twin. Gostaríamos de agradecer a Barry Ganetzky e David Wassarman por discussões animadas que, sem dúvida, melhoraram a ciência e Kent Mok, Cayla Guerra e Bailey Spiegelberg por suas contribuições para o laboratório. Os anticorpos FasII foram desenvolvidos por Corey Goodman e obtidos do Banco Hybridoma de Estudos de Desenvolvimento, criado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA 52242. A maioria das cepas de Drosophila utilizadas neste estudo foram obtidas do Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Este trabalho foi apoiado pelo NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); a Escola de Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin (GBF); e o UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |