גירוי וניתוח נוירוגנזה למבוגרים במוח המרכזי של דרוזופילה

פרוטוקול זה פועל על פי הנחיות הטיפול בבעלי חיים של UW-מדיסון. 1. יצירת Drosophila למבוגרים עבור PTBI עבור הצלב הסטנדרטי, מקם 20 בתולה y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 נקבות בוגרות ו-10 y[1] w[1]17 גברים בוגרים טסים יחד בבקבוקונים (ראו טבלת חומרים) המכילים מזון. כדי שיהיו מספר גדול של צאצאים סינכרוניים, הגדר 10-20 צלבים בו זמנית. הצלב הסטנדרטי מעורר צאצאי F1 של הגנוטיפ: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; אוקיי107-GAL4/+. מניחים את הבקבוקונים ב 25 °C (75 °F) להזדווגות והטלת ביצים. כדי למקסם את האבן, להעביר את ההורים בקבוקונים חדשים כל 2-4 ימים, שמירה על הבקבוקונים המוקדמים ב 25 °C (70 °F). יש להשליך כל מקטורן 18 יום לאחר שההורים הונחו בו לראשונה כדי להבטיח שאין צאצאי F2.הערה: ניתן להפיק 3 קבוצות של צאצאים (“מהורהרים”) מכל קבוצה של הורים. בדוק לאחר ~ 10 ימים, כאשר הצאצאים F1 יתחילו להתפרק. למחקרי שושלת היוחן, השתמש F1 זכרים תאומים פרמה15 של גנוטיפ: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-מיר/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-מיר; אמבטיה-GAL80ts / מעשה GAL4 UAS-flp. עבור עקביות, לעשות את הצלב הזה באותו כיוון בכל פעם. כדי ליצור זכרים תאומים פרמה, מקום 20 בתולה w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-מיר; נקבות אמבטיה-GAL80ts/TM6B ו-10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-מיר; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 זכרים בוגרים יחד בבקבוקונים המכילים מזון. מניחים את הבקבוקונים ב 17 °C (7 °F) להזדווגות והטלת ביצים. העבר הורים לבקבוקונים של מזון חדש כל 7 ימים, שמירה על כל הבקבוקונים ב 17 °C (7 °F). להשליך כל מקטורן 35 ימים לאחר ההורים הונחו בו לראשונה כדי להבטיח כי אין צאצאי F2. בדוק לאחר ~ 21 ימים, כאשר הצאצאים F1 יתחילו להתפרק. 2. פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI;  איור 1) מיין זבובי F1 חדשים. בחר זכרים צעירים בתוך 6 שעות לאחר אקסלוסיה. מניחים את הזכרים האלה בבקבוקונים נקיים המכילים מזון, עם 40 זבובים או פחות לכל בקבוקון.הערה: זה מושג בקלות רבה ביותר באמצע הבוקר על ידי עשיית זבובים על כרית CO2 וזיהוי זכרים בוגרים שעדיין יש להם meconium (גלוי כנקודה ירקרקה כהה דרך דופן הבטן) במעיים שלהם. קדם-הזנה עם 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) (ראה טבלת חומרים) עבור 6 שעות לפני הפציעה אם מתכננים לסמן חלוקת תאים עם EdU. ראה שלב 3 לקבלת פרטים. לחטא סיכות Minutien (ראה שולחן חומרים) במשך 5 דקות לפחות על ידי הצבת ~ 100 סיכות בצינור microcentrifuge 1.5 מ”ל מלא 70% אתנול. יש לחטא את משטח הפחמן הדו-חמצני ואת המכחול על ידי ריסוס 70% אתנול ונגב יבש עם רקמה נקייה ללא מוך. לאחר שהכלים נקיים ויבשים, העבירו 40 זכרי F1 ממוינים או פחות בחזרה למשטח הנקי. הפרד את זכרי F1 לשתי קבוצות על משטח הזבוב. קבוצה אחת תשמש כשליטה, זבובים ללא פגע. קבוצת הניסוי השנייה תהיה כפופה ל-PTBI. באמצעות מלקחיים, למשוך 4-5 סיכות Minutien חדש מתוך צינור microcentrifuge ומניחים אותם ליד הקצה של כרית CO2 . תחת טווח הניתוח, בחר סיכת Minutien ישרה עם נקודה חדה.הערה: שימוש בסיכת Minutien אחת לניסוי יפחית את השונות. לעשות שימוש חוזר בפינים חדים. מניחים סיכות פגומות או קהות בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ”ל המכיל 70% אתנול לסילוק בטוח. אם אתם עובדים עם זבובים מהצלב הסטנדרטי, הדליקו את מנורת הדיודה פולטת האור (LED) של מיקרוסקופ סטריאו המצוידת במסנני העירור והפליטה המתאימים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זה מאפשר עירור ב 440-460 ננומטרי ומאפשר הדמיה של 500-560 ננומטר.הערה: עם המנורה ומסנן זה, גופי התא של גוף הפטריות יהיה פלואורסצ’ה ירוק דרך חתך הראש (איור 1C). עבור זבובים או זבובים של גנוטיפים אחרים, ניתן להשתמש במאיר אור לבן סטנדרטי למיקרוסקופ הסטריאו כדי לדמיין ציוני דרך על גוון הראש למיקוד הפגיעה בגוף הפטריות (איור 1C). השתמש במלקחיים כדי להרים ולהחזיק את סיכת Minutien שנבחרה ביד אחת (עבור אנשים ימניים, זה בדרך כלל יד ימין) ואת מברשת צבע ביד השנייה (בדרך כלל שמאל). בחר זבוב מקבוצת הניסוי ומיקם את הזבוב כך שיש לך מבט על גופרית של קפסולת הראש עם ראש הזבוב ימינה. מניחים את המברשת על החלק המקדים של בית החזה של גבי ולדחוף למטה בעדינות כדי לייצב את הזבוב. כוונו את קצה סיכת Minutien לגופי התא של גוף הפטרייה בצד ימין של הראש וחדרו את כמוסת הראש. אם אתם משתמשים בציוני דרך, כוונו לחתך הראש הגבי בין האוקלי לשפת הגב של העין (איור 1). לאחר השלמת הפציעה, השתמש במכחול כדי לדחוף את הראש בעדינות את סיכת Minutien. אם אתם משתמשים במוח עבור RNA-Seq או qRT-PCR, הפוך לפציעה שנייה בצד שמאל של הראש. חזור על שלבים 2.8-2.10 כדי לפגוע בכל הזבובים בקבוצת הניסוי. לאחר שכל הזבובים נפצעו, הניחו את השליטה ופגעו בזבובים לתוך בקבוקונים נפרדים ומסומנים המכילים מזון. הנח את הבקבוקונים אופקית (כלומר, בצדדים שלהם) בעוד הזבובים להתאושש מן ההרדמה ובמהלך ההזדקנות לאחר מכן כדי למנוע זבובים להיתפס במזון. צלב רגיל טס במהירות של 25 °C (70 °F), וטיסות פרמה-טווין ב 30 °C (50 °F) עד גיל. עבור זבובים בגילאי יותר מ 24 שעות, מניחים אותם על מזון נקי כל 1-2 ימים. 3. תיוג EdU הכן מלאי של 10 mM 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (50 °F) עד 12 חודשים. הכן 200 μL של 50 מיקרומטר EdU ב 10% סוכרוז. קדם-הזנה טסה עם EdU במשך 6 שעות לפני PTBI. מקם 200 μL של 50 μM EdU ב 10% סוכרוז על נייר מסנן כיתה 3 עגול 23 מ”מ (ראה שולחן חומרים) בחקירה ריקה אחרת. מניחים את הזבובים בוויון. ואז לאטום את המשחקון עם תקע כותנה. מניחים את הנקיל אופקית באינקובטור לח ב 25 °C (6 °F) במשך 6 שעות. בצע PTBI כמתואר בשלבים 2.3-2.10. מחזירים את הזבובים לפוען המכיל את EdU. אוטמים את הוויאל עם תקע כותנה. מניחים את הקרבון אופקית באינקובטור לח ב 25 °C (75 °F) עד 24 שעות. בצע את אחד השלבים המתוארים להלן (שלב 3.8.1-3.8.3). לנתח ולתקן את המוחות כמתואר בשלב 4 באמצעות חיץ קיבוע, לשטוף ולחסום ללא אזיד ועם תגובת הזיהוי של EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים. העבר את הזבובים לנקניקיה נקייה המכילה נייר מסנן חדש ו 200 μL של 50 μM EdU ב 10% סוכרוז. מניחים את הקרבון אופקית באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה כל 24 שעות במהלך תיוג. לאחר מכן, לנתח ולתקן את המוח כפי שמתואר בשלב 4 באמצעות חוצצים ללא אזיד עם תגובת זיהוי EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים. כדי לתווית מרדף דופק עם EdU, להאכיל את EdU לתקופת הדופק, להעביר את הזבובים כל 24 שעות לפקעת נקייה המכילה נייר מסנן חדש ו 200 μL של 50 מיקרומטר ב 10% סוכרוז. לאחר תקופת הדופק (למשל, 4 ימים), מעבירים את הזבובים למוסך המכיל מזון דרוסופיל סטנדרטי. מניחים את הנקריאל על צידו בחממה של 25 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים נוספים. לאחר מכן, לנתח ולתקן את המוח כפי שמתואר בשלב 4 באמצעות חוצצים ללא אזיד עם תגובת זיהוי EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים. 4. דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה, והרכבה הכן צינורות microcentrifuge 1.5 מ”ל עם 100 μL של קבוע: 4% פורמלדהיד ב- PEM (100 mM piperazine-N,N’bis (חומצה 2-אתנסולפונית) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0) (ראה שולחן חומרים) ומניחים על קרח.הערה: עד 20 מוחות של גנוטיפ אחד ומצב ניתן לעבד בצינור אחד. הכן צלחת ביתור עם בריכה קטנה אחת (~ 100 μL) של 70% אתנול ושלוש בריכות קטנות של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS; 100 מ”ר של K2HPO4, 140 מ”ר של NaCl, pH 7.0). אני מרדים ~ 10 שליטה או זבובים ניסיוניים על כרית CO2 שחוטאה עם 70% אתנול. להפריד את הראש מתא המטען של כל זבוב באמצעות אזמל. אוספים את הראשים עם מברשת צבע רטובה ב-70% אתנול ומניחים את הראשים במשך 2-5 דקות בבריכת האתנול על צלחת הניתוח.הערה: זה מעט מייבש את המוחות ועושה אותם קל יותר לנתח מן חתך הראש. העבר את הראשים למאגר ~ 100 μL של PBS ולנתח את המוח, העברת כל מוח למאגר נקי ~ 100 μL של PBS. בצע זאת באמצעות שני זוגות של מלקחיים שענים כדי לפתוח את החלק האחורי של חתך הראש ולהחזיק את החתך עם זוג אחד של מלקחיים תוך חטטנות עדינה את המוח מתוך החתך באמצעות הקצה הסגור של זוג המלקחיים השני. העבר את המוחות נותחו לצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של פתרון התיקון באמצעות pipettor P200 מצויד קצה פלסטיק כי כבר חתוך משופע כדי לאפשר כניסה של המוח. לתקן במשך 20-25 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את התיקון עם P200 או פיפטה זכוכית. לשטוף את המוח הקבוע ארבע פעמים עם 1 מ”ל של ‘PT’ (PBS בתוספת 0.1% Triton X-100), ומאפשר למוח להסתפק במשך מספר דקות בין כל לשטוף.הערה: אם המוחות אינם מתיישבים במהירות בין הכביסות, סביר להניח שיש להם עדיין גוף שומן ו /או קנה הנשימה מחובר. דגימות בלוק ב 1 מ”ל של PBS בתוספת 0.1% Triton X-100 ו 2% אלבומין סרום בקר (PBT) עבור ~ 1 שעה בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון חסימה ודגימות דגירה עם 100 μL של פתרון נוגדנים ראשוני לילה ב 4 °C ב PBT. הנוגדנים העיקריים המשמשים במחקר זה הם ארנב אנטי PH3 (1:500) ועכבר אנטי פאסיקלין II (1:20) (ראה טבלה של חומרים). לשטוף דגימות חמש פעמים עם 1 מ”ל של PT, המאפשר למוח להסתפק במשך כמה דקות בין כל לשטוף. הסר את הכביסה הסופית ודגרה ב 100 μL של פתרון נוגדן משני לילה ב 4 °C (70 °F). הנוגדנים המשניים המשמשים כאן הם אנטי ארנב 568 (1:400) ו- Cy5 נגד העכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים). לשטוף דגימות חמש פעמים עם 1 מ”ל של PT, המאפשר למוח להסתפק במשך כמה דקות בין כל לשטוף. במהלך הכביסה הסופית, להוסיף 4′,6-Diamidino-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI; 1:100 של פתרון 10 מיקרומטר) במשך 10 דקות כדי להכתים את הגרעינים. הסר את הכביסה, משאיר 50-100 μL בכל צינור. הכן שקופיות מיקרוסקופ על-ידי הצבת תווית חיזוק יחידה עם דבק עצמי באמצע כל שקופית ולט טיפה של 50 μL של מדיה נגד עמעום במרכז כל תווית (ראה טבלת חומרים). תווית החיזוק מחזיקה את כיסוי הכיסוי מעט מעל המגלשות ומונעת מהמוחות המותקנים להיות שטוחים יתר על המידה. העבירו בזהירות את המוח מכל צינור מיקרוצנטריפוגה לשקופית מוכנה עם כמה שפחות חוצץ כביסה באמצעות P200 המצויד בקצה פלסטיק חתוך ומפופע. עד 10 מוחות יכולים להיות מותקנים בשקופית אחת. השתמש במלקחיים כדי למקם מחדש בעדינות את המוח לפני הנחת כיסוי על כל שקופית ואיטום המגלשה עם לק. כוון את המוח עם הצד האחורי למעלה או הצד הקדמי למעלה, אך לא צריך לגעת זה בזה.הערה: מכיוון שקשה להשיג תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה דרך מוח שלם, יש להרכיב מוחות מסוימים בכל כיוון. יש לאחסן שקופיות מוכנות שטוחות ובחשיכה ב-4 מעלות צלזיוס עד להדמיה. לאחסון לטווח ארוך יותר (עד שנה אחת), ניתן לאחסן שקופיות ב- -20 °C (70 °F). 5. הדמיה קונפוקלית הערה: מוחות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם לייזרים עירור וקוביות מסנן פליטה המתאימות DAPI ואת הנוגדנים המשניים פלואורסצנטי (כלומר, 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 568 ננומטר, 633 ננומטר, בהתאמה). הפעל את העוצמה של המיקרוסקופ, הלייזרים, הבקר והמחשב. פתח את תוכנת הרכישה. במצב רכישה, בחר עד ארבעה ערוצים והגדר את הפרמטר לסריקה רציפה של הערוצים הרצויים. הגדל את כוח הלייזר עבור כל ערוץ ל-5-10%. מקם שקופית על המיקרוסקופ. בחר מוח להיקרא באמצעות קובץ מצורף epifluorescence (ראה טבלה של חומרים). במצב רכישה, בחר 1024 x 1024 פיקסלים כממד המסגרת. במצב רכישה, בחר באפשרות Z-stack, ציין שיש לקחת מחסנית Z במקטעים של 2 מיקרומטר, ולהתמקד במדגם, תוך בחירת המישורים המוקדיים העליונים והתחתונים שיש לדמיין. לאסוף Z-מחסנית תמונות של מוחות שלמים באמצעות מטרה 20x ואזורי מוח ספציפיים כגון גוף הפטריות באמצעות מטרה 60x. 6. ניתוח נתונים לכמת את התאים המתרבים ואת המספרים של שיבוטים תאומים פרמה באופן ידני ו / או באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים). בעת שימוש בתוכנה, בחר אזורי עניין (ROIs) עם אזורים של לפחות 10 מיקרומטר.