DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Dairesel dikroizm (CD), sağ elini kullanan ve solak dairesel polarize ışığın diferansiyel emilimine yol açan biyolojik makromoleküllerin doğal chiralitesine dayanan spektroskopik bir tekniktir. Bu diferansiyel emilim dairesel dikroizm olarak bilinir. Bu nedenle teknik, her ikisi de chiral merkezleri içeren proteinler ve DNA gibi biyolojik makromoleküllerin konformasyonunu tanımlamak için ^{kullanılabilir1,2}.

Elektromanyetik dalgalar hem elektrik hem de manyetik bileşenler içerir. Hem elektriksel hem de manyetik alanlar dalga yayılma yönüne dik olarak salınır. Kutuplaşmamış ışık durumunda, bu alanlar birçok yönde salınır. Işık dairesel olarak polarize edildiğinde, birbirine 90° faz farkıyla iki elektromanyetik alan elde edilir. Chiral molekülleri dairesel optik dönüş (birefringence) gösterir, böylece sağ elle dairesel polarize ışığı ve solak dairesel polarize ışığı farklı derecelerde emerler3. Elde edilen elektrik alanı, dalga boyunun bir işlevi olan elips olarak izlenecektir. CD spektrumu böylece eliptiklik (q) olarak kaydedilir ve veriler dalga boyunun bir işlevi olarak Ortalama Kalıntı Eliptikliği olarak sunulur.

Proteinler söz konusu olduğunda, amino asitlerin Cα’ları (glisine hariç) chiral’dır ve bu makromolekül4’ün ikincil yapısını belirlemek için CD spektroskopisi ile yararlanılmıştır. Protein moleküllerinin CD spektrumları tipik olarak Uzak UV aralığında kaydedilir. α-sarmal proteinler 222 nm ve 208 nm’de iki negatif bant ve 193 ^nm4’te bir pozitif zirveye sahiptir. Anti-paralel β yaprak ikincil yapıya sahip proteinler 218 nm’de negatif bir zirve ve 195 ^nm4’te pozitif bir zirve gösterir. Düzensiz yapılara sahip proteinler 210 nm’ye yakın düşük eliptiklik ve 195 ^nm4’te negatif bir zirve gösterir. Bu nedenle, farklı ikincil yapılar için iyi tanımlanmış tepe / bantlar, CD’yi denatürasyon ve ligand bağlama sırasında proteinlerin ikincil yapısında meydana gelen konformasyonel değişiklikleri aydınlatmak için uygun bir araç haline getirir.

Nükleik asitlerin üç tane chirality kaynağı vardır: şeker molekülü, ikincil yapının helitesi ve ortamdaKI DNA’nın uzun menzilli üçüncül ^sırası5,6. Nükleik asitlerin CD spektrumları tipik olarak 190 ila 300 nm aralığında ^{kaydedilir5,6}. DNA’nın her uyumu, tıpkı proteinler gibi karakteristik bir spektrum sağlar, ancak tepeler / bantlar çözücü koşullar ve DNA dizilerindeki farklılıklar nedeniyle bir dereceye kadar ^{değişebilir7}. En yaygın form olan B-DNA, 260-280 nm civarında pozitif bir zirve ve 245 ^nm6 civarında negatif bir tepe ile karakterizedir. B formu DNA’sının zirveleri/bantları genellikle küçüktür, çünkü baz çiftleri çift sarmala diktir ve moleküle zayıf bir chirality tanır. A-DNA 260 nm’de baskın pozitif zirve ve 210 ^nm6 civarında negatif bir zirve verir. Solak sarmal olan Z-DNA, 290 nm’de negatif bir bant ve 260 ^nm6 civarında pozitif bir zirve sağlar. Bu DNA aynı zamanda 205 ^nm6’da son derece negatif bir zirve verir.

Bu konformasyonlara ek olarak, DNA tripleksler, dört yönlüler ve saç tokaları da oluşturabilir ve bunların hepsi CD spektroskopisi ile ayırt edilebilir. Paralel G-quadruplex 260 nm’de baskın pozitif bant verirken, paralel karşıtı G-quadruplex 260 nm’de negatif bir bant ve 290 nm’de pozitif bir zirve vererek iki dört yönlü yapı biçimini ayırt etmeyi ^{kolaylaştırır6}. Tripleks karakteristik bir spektrum ^vermez8. Örneğin, Na⁺ varlığında G.G.C ve T.A.T baz çiftlerini içeren intramoleküler üçlü sarmal oluşturma potansiyeline sahip 36 nükleotid uzunluğundaki DNA’nın spektrumu 240 nm’de güçlü bir negatif bant ve geniş bir pozitif zirve göstermektedir. Geniş pozitif zirve 266, 273 ve 286 nm’de katkıları göstermektedir. Na+ ve ^Zn+‘nın varlığında aynı oligonükleotid dört negatif bant (213, 238, 266 ve 282 nm) ve 258 nm’de pozitif bir zirve gösterir. Bu nedenle, tripleks DNA tayfı tuz koşullarına bağlı olarak ^{değişebilir8}.

Bu konformasyonlara ek olarak, CD spektrası X-DNA adı verilen başka bir DNA formunun tanımlanmasını sağlamış. DNA dizisi alternatif adenin ve timin kalıntıları içerdiğinde X-DNA oluşur. X-DNA’nın CD spektrumları 250 ve 280 nm’de iki negatif tepe içerir. X-DNA hakkında çok az bilgi mevcuttur, ancak pozitif supercoiling için bir lavabo işlevi görebilmiştir6,9. CD spektrumlarındaki değişiklikler ligand-protein etkileşimleri hakkında da ayrıntıları ortaya getirebilir ve bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerini tespit etmek için moleküler yöntemlerin cephaneliğine eklenmiştir10,11,12,13,14. CD spektrumları, katlama işlemi sırasında proteinlerin ikincil yapısındaki değişiklikleri izlemek için de ^{kullanılmıştır15}. Benzer şekilde, CD spektrumları ligand-DNA etkileşimlerini yoklamada da ^{kullanılabilir16,17}.

Cd spektroskopisi, bu nedenle, çok ucuz olmayan ekipman ve yazılımlara erişim olması koşuluyla, farklı DNA uyum biçimlerini ayırt etmek için kolay ve ucuz bir yöntemdir. Yöntem son derece hassas ve hızlıdır. Sadece az miktarda DNA gerektirir, bu da ona alternatif nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi tekniği üzerinde bir avantaj sağlar. Ligandlar ve substratlar ile titrasyonların yapılması da kolaydır. En büyük kısıtlama DNA’nın son derece saf olması gerektiğidir. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) saflaştırılmış DNA kullanılması tavsiye edilir.

CD spektrası tarafından elde edilen bilgiler esas olarak protein yapısal özelliklerini çıkarmak ve farklı DNA uyumlularını tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada CD spektrası, in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) deneyinden elde edilen sonuçları entegre etmek için, ilgi proteininin /tahmin edilen transkripsiyon faktörünün efektör genlerinin promotör bölgesinde konformasyonsal bir değişiklik getirip getirmeyeceğini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu işbirliği, bir organizatörün transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) üzerinde ve çevresinde öngörülen transkripsiyon faktörü tarafından transkripsiyon düzenleme mekanizmasını tahmin ederek geleneksel CD spektroskopik tekniklerinin ilerlemesine yardımcı olur.

Kromatin remodeling, sıkıca paketlenmiş kromatin transkripsiyon faktörleri, DNA replikasyonu bileşenleri veya hasar onarım proteinleri gibi çeşitli düzenleyici faktörler için erişilebilir hale getirerek DNA metabolik süreçlerini düzenlediği bilinen iyi tanımlanmış bir mekanizmadır. SWI/SNF protein ailesi olarak da bilinen ATP’ye bağımlı kromatin remodelerleri, ökaryotik hücrelerde bulunan anahtar remodeler ^{proteinlerdir18,19}. Filogenetik kümeleme, SWI/SNF protein ailesini 6 alt gruba ^{ayırmıştır20}: Snf2 benzeri, Swr1 benzeri, SSO1653 benzeri, Rad54 benzeri, Rad5/16 benzeri ve uzak. Bu çalışmada ilgi çekici protein olan SMARCAL1, uzak alt gruba ^aittir20. Bu protein, CD spektroskopisi kullanılarak transkripsiyonal regülasyon şeklini araştırmak için kullanılmıştır.

ATP’ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin üyelerinin çoğunun nükleozomları yeniden konumlandırdığı veya tahliye ettiği veya histone varyant değişimine ATP’ye bağımlı bir şekilde aracılık ettiği ^{gösterilmiştir21,22}. Ancak, bu ailenin bazı üyelerinin nükleozomları yeniden şekillendirdiği gösterilmemiştir, örneğin SMARCAL1. Çalışmalar SMARCAL1’in politen kromozomlarla ilişkili olduğunu göstermiş olsa da, nükleozomları yeniden şekillendirme yeteneğine ilişkin deneysel kanıtlar ^eksiktir23. Bu nedenle, SMARCAL1’in ^DNA24 konformasyonunu değiştirerek transkripsiyon düzenleyebileceği ileri sürüldü. CD spektroskopisi, bu hipotezi doğrulamak için kolay ve erişilebilir bir yöntem sağladı.

SMARCAL1, öncelikle tavlama ^{helicase25,26,27} olarak işlev gören atp bağımlı kromatin remodeling proteinidir. DNA konformasyonunu yeniden şekillendirerek transkripsiyonu modüle etmek için postülasyon ^{edilmiştir24}. Bu hipotezi test etmek için, doksrubisin kaynaklı DNA hasarı sırasında gen transkripsiyonunun düzenlenmesinde SMARCAL1’in rolü incelenmiştir. Bu çalışmalarda in vivo analiz için SMARCAL1, in vitro tahliller için ADAAD ^{kullanılmıştır28,29}. Önceki çalışmalar ADAAD’ın DNA’yı yapıya bağımlı ancak diziden bağımsız bir şekilde tanıyabileceğini ^{göstermiştir30,31}. Protein, kök döngü DNA’sına benzer şekilde tek iplikli geçiş bölgelerine çift iplikli dna moleküllerine en uygun şekilde bağlanır ve ATP ^30,31’i hidroller.

In vivo deneyler, SMARCAL1’in organizatör bölgelerine bağlanarak MYC, DROSHA, DGCR8 ve DICER’ın ifadesini düzenlediğini ^{gösterdi28,29}. Etkileşim bölgesi ChIP deneyleri ^{ile belirlendi28,29}. ChIP tekniği, bir proteinin hücre içindeki konyak DNA’sı ile etkileşimini analiz etmek için kullanılır. Amacı, organizatörler veya diğer DNA bağlama bölgelerindeki transkripsiyon faktörleri gibi belirli proteinlerin belirli genomik alanlara bağlı olup olmadığını belirlemektir. DNA’ya bağlı protein ilk olarak formaldehit kullanılarak çapraz bağlanır. Bunu kromatin izolasyonu takip ediyor. İzole kromatin, sonikasyon veya nükleaz sindirimi ile 500 bp parçaya yamaçlanır ve DNA’ya bağlı protein, proteine özgü antikorlar kullanılarak bağışıklık sistemine bağlıdır. Çapraz bağlama tersine çevrilir ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya nicel gerçek zamanlı PCR kullanılarak analiz edilir.

ChIP sonuçları, SMARCAL1’in bu genlerin promotör bölgelerinde konformasyonel bir değişiklik yaratarak transkripsiyonel düzenlemeye aracılık ettiği hipotezine yol açtı. QGRS haritalayıcı ve Mfold yazılımı, bu organizatör bölgelerinin ikincil yapılar oluşturma potansiyelini belirlemek için ^{kullanıldı28,29}. QGRS eşleyici G-quadruplexes32’yi tahmin etmek için kullanılırken, ^Mfold33 bir sıranın kök döngüler gibi ikincil yapılar oluşturma yeteneğini analiz eder.

İkincil yapı analizinden sonra, Escherichia coli34’ten arındırılmış SMARCAL1’in sığır homologu olan rekombinant 6X His etiketli Aktif DNA’ya bağımlı ATPase A Domain (ADAAD) ile daha fazla in vitro deney yapıldı. ATPase tahlilleri ADAAD kullanılarak gerçekleştirildi ve tanımlanan DNA dizilerinin efektör olarak işlev görebileceğini ^{belirledi28,29}. Son olarak ^ADAAD28,29 tarafından DNA molekülünde indüklenen konformasyon değişikliklerinin izlenmesi için CD spektroskopisi yapıldı.

Proteinin ATPase aktivitesinin DNA molekülünde konformasyonel bir değişime neden olmak için gerekli olduğunu kanıtlamak için, şelat Mg ^+2’ye etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) veya SWI/SNF proteininin spesifik bir inhibitörü olan Aktif DNA’ya bağımlı ATPase A Domain Inhibitörü Neomycin (ADAADiN) ^eklendi35.36 . Bu CD spektroskopik tekniği, chIP veya diğer ilgili testlerle bir organizatörün tahmin edilen genomik bölgesine bağlanmak için gösterilen herhangi bir saflaştırılmış proteinle kullanılabilir.