DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

円二色性(CD)は、右利きと左利きの円偏光の差動吸収につながる生体高分子の固有のキラリティに依存する分光技術です。この差動吸収は、円形のジクロリズムとして知られています。したがって、この技術は、キラル^{センター1,2}を含むタンパク質およびDNAなどの生物学的高分子の立体構造を表現するために使用することができる。

電磁波には、電気と磁気の両方のコンポーネントが含まれています。電気と磁界は、波の伝播方向に対して垂直に振動します。偏光のない光の場合、これらのフィールドは多くの方向に振動します。光が円偏光すると、互いに90°位相差で2つの電磁場が得られます。キラル分子は、右利きの円偏光と左利きの円偏光を異なる範囲に吸収するような円状の光学回転(複屈折)を示す³。得られた電界は、波長の関数である楕円としてトレースされます。このCDスペクトルは、このように、楕円度(q)として記録され、データは波長の関数として平均残基楕円度として提示される。

タンパク質の場合、アミノ酸のCα(グリシンを除く)はキラルであり、これはCD分光法によって利用され、この高分子⁴の二次構造を決定する。タンパク質分子のCDスペクトルは、通常、遠紫外線範囲で記録されます。αヘリカルタンパク質は、222 nmおよび208 nmで2つの陰性バンドを有し、193 ^nm4で1つの正のピークを有する。抗平行βシート二次構造を有するタンパク質は、218 nmで負のピークを示し、195 ^nm4で正のピークを示す。無秩序な構造を有するタンパク質は、210 nm付近の低い楕円性と195 ^nm4で負のピークを示す。したがって、異なる二次構造の明確なピーク/バンドは、CDを作る変性とリガンド結合の間にタンパク質の二次構造に起こる構造変化を解明するための便利なツールです。

核酸には、糖分子、二次構造のヘリシティ、および環境中のDNAの長期三次配列の3つの源があります^5,6。核酸のCDスペクトルは、典型的には190〜300 nm範囲^5,6で記録^される。DNAの各立体構造は、タンパク質と同様に特徴的なスペクトルを与えますが、ピーク/バンドは溶媒条件とDNA配列の違いのためにある程度変化する可能性があります⁷。最も一般的な形態であるB-DNAは、260〜280 nm前後の陽性ピークと245 ^nm6の周りの陰性ピークによって特徴付けられる。B型DNAのピーク/バンドは、塩基対が二重らせんに垂直であるため、一般的に小さく、分子に弱いキラリティを与える。A-DNAは260 nmで優勢な陽性ピークを与え、210 ^nm6の周りに陰性のピークを与える。左利きのらせんであるZ-DNAは、290nmで陰性バンドを与え、260 ^nm6の周りに正のピークを与える。このDNAはまた、205 ^nm6で非常に陰性のピークを与える。

これらの立体構造に加えて、DNAはトリプレックス、四重プレックス、ヘアピンを形成することができ、そのすべてがCD分光法によって区別することができる。並列G-quadruplexは260nmで優勢な正のバンドを与え、反平行G-quadruplexは260 nmで負のバンドを与え、290 nmで正のピークを与え、2つの形態の四重プレックス構造⁶を区別することを容易にする。トリプレックスは特徴的^{なスペクトル8}を与えない。例えば、Na⁺ 存在下でG.G.CとT.A.T塩基対を含む分子内三重らせんを形成する可能性のある36ヌクレオチド長DNAのスペクトルは、240nmで強い陰性バンドを示し、広い陽性ピークを示す。広い正のピークは266、273、および286 nmの貢献を示す。Na⁺ およびZn⁺ の存在下での同じオリゴヌクレオチドは、4つの陰性バンド(213、238、266、および282 nm)および258nmで陽性のピークを示す。したがって、トリプレックスDNAのスペクトルは、塩条件に応じて変化する^{可能性がある8}。

これらの立体構造に加えて、CDスペクトルはX-DNAと呼ばれる別の形態のDNAの同定を可能にした。X-DNAは、DNA配列に代替アデニンおよびチミン残基が含まれるときに形成される。X-DNAのCDスペクトルは250および280 nmの2つの陰性ピークを含んでいる。X-DNAに関する情報はほとんどないが、陽性スーパーコイル^6,9のシンクとして^{機能すると推測}されている。CDスペクトルの変化はまた、リガンドとタンパク質相互作用に関する詳細を明らかにすることができ、したがって、薬物タンパク質相互作用を検出するための分子方法の武器庫に追加された^{10、11、12、13、14}。CDスペクトルは、折り畳みプロセス¹⁵中のタンパク質の二次構造の変化を監視するためにも使用されてきた。同様に、CDスペクトルは、リガンドとDNA相互作用の調査にも使用できる^16,17。

CD分光法は、このように、DNAの構造の異なる形態を区別する容易で安価な方法であり、それほど安価ではない機器およびソフトウェアへのアクセスがある場合である。この方法は非常に敏感で迅速です。少量のDNAしか必要としないため、核磁気共鳴(NMR)分光法の代替技術に優位性を与えます。リガンドや基質を用いた滴定も容易に行えます。主な制約は、DNAが非常に純粋でなければならないということです。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製DNAを使用することをお勧めします。

CDスペクトルによって得られた情報は、主にタンパク質の構造特徴を推測し、明確なDNA適合体を同定するために使用されてきました。本研究では、イン ビボ クロマチン免疫沈降(ChIP)実験から得られた結果を統合し、目的のタンパク質/予測転写因子がそのエフェクター遺伝子のプロモーター領域に立体構造変化をもたらすかどうかを示すために使用されています。このコラボレーションは、プロモーターの転写開始部位(TSS)とその周辺で予測された転写因子による転写調節機構を予測することにより、従来のCD分光技術の進行を助ける。

クロマチンリモデリングは、密に詰まったクロマチンを転写因子、DNA複製の構成要素、損傷修復タンパク質などの様々な調節因子にアクセスできるようにすることで、DNA代謝プロセスを調節することが知られている明確なメカニズムです。ATP依存クロマチンリモデル剤は、SWI/SNFファミリーのタンパク質とも呼ばれ、真核細胞に存在する主要なリモデルタンパク質^{である18,19です}。系統的クラスタリングは、SWI/SNFファミリーのタンパク質を6つのサブグループ²⁰に分類しました:Snf2のような、Swr1のような、SSO1653のような、Rad54のような、Rad5/16のような、そして遠く離れています。本研究で関心のあるタンパク質であるSMARCAL1は、遠方のサブグループ²⁰に属する。このタンパク質は、CD分光法を用いた転写調節の様式を調べるのに用いられている。

ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質のメンバーのほとんどは、核酸を再位置または除去するか、またはATP依存的な様式でヒストン変異体交換を媒介することが示されている^21,22。しかし、このファミリーの一部のメンバーは、例えばSMARCAL1のヌクレオソームを改造することが示されていない。SMARCAL1がポリテネ染色体と関連することが研究で示されているにもかかわらず、ヌクレオソームを改造する能力に関する実験的証拠は欠けている^23。そこで、SMARCAL1は^DNA24の立体構造を変化させることによって転写を調節する可能性があると仮定した。CD分光法は、この仮説を検証するための簡単でアクセス可能な方法を提供した。

SMARCAL1は、主にアニーリングヘリカーゼ^25,26,27として機能するATP依存クロマチンリモデリングタンパク質^です。DNAコンフォメーション²⁴を改造して転写を変調するように仮定されている。この仮説を検証するために、ドキソルビシン誘発DNA損傷時の遺伝子転写を調節するSMARCAL1の役割を検討した。これらの研究では、SMARCAL1はインビボ分析とADAADのインビトロアッセイ^28,29に使用されました。これまでの研究では、ADAADは構造に依存するが配列に依存しない方法でDNAを認識できることが示されています^30,31。このタンパク質は、ステムループDNAと同様に、二本鎖を有するDNA分子と一本鎖転移領域に最適に結合し、ATP ^30,31を加水分解する。

インビボ実験は、SMARCAL1がプロモーター領域^28,29に結合することによってMYC、DROSHA、DGCR8およびDICERの発現を調節することを示した。相互作用の領域は、ChIP実験^28,29によって同定された。ChIP技術は、細胞内の同一DNAとタンパク質の相互作用を分析するために使用されます。その目標は、プロモーターまたは他のDNA結合部位上の転写因子などの特定のタンパク質が特定のゲノム領域に結合しているかどうかを判断することです。DNAに結合したタンパク質は、ホルムアルデヒドを用いて最初に架橋される。その後、クロマチンの単離が続きます。分離されたクロマチンは、超音波処理またはヌクレアーゼ消化のいずれかによって500bp断片に切断され、DNAに結合したタンパク質は、タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降する。架橋は逆転し、DNAはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量的リアルタイムPCRを用いて分析されます。

ChIPの結果は、SMARCAL1がこれらの遺伝子のプロモーター領域の立体構造変化を誘導することによって転写調節を媒介する可能性があるという仮説につながった。QGRSマッパーおよびMfoldソフトウェアは、これらのプロモーター領域が二次構造を形成する可能性を同定するために使用された^28,29。QGRSマッパーはG-quadruplexes32の予測に使用され、^Mfold33はステムループなどの二次構造を形成するシーケンスの能力を分析します。

二次構造解析の後、さらにインビトロ実験を組換え6X Hisタグ付き活性DNA依存ATPase Aドメイン(ADAAD)、SMARCAL1のウシホモログ、大腸菌から精製したATPaseアッセイは、同定されたDNA配列がエフェク^ター28,29として作用し得ることを確立するためにADAADを用いて行った。最後に、^ADAAD28,29によってDNA分子に誘導された立体構造変化をモニターするためにCD分光法を行^った。

タンパク質のATPase活性がDNA分子の立体構造変化を誘導するために不可欠であることを証明するために、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)をキレートMg⁺²または活性DNA依存ATPase Aドメイン阻害剤ネオマイシン(ADAADiN)^{に添加した}。.このCD分光技術は、プロモーターの予測ゲノム領域に結合するために、ChIPまたは他の任意の関連アッセイによって実証された任意の精製タンパク質と利用することができる。