التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

الديسكروزم الدائري (CD) هو تقنية طيفية تعتمد على التشهر المتأصل في الجزيئات الكلية البيولوجية التي تؤدي إلى امتصاص تفاضلي للضوء المستقطب بشكل دائري باليد اليمنى والأعسر. ويعرف هذا الامتصاص التفاضلي باسم الإملاء الدائري. ولذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد تشكيل الجزيئات البيولوجية، مثل البروتينات والحمض النووي، وكلاهما يحتوي على مراكز ^chiral1،2.

الموجات الكهرومغناطيسية تحتوي على كل من المكونات الكهربائية والمغناطيسية. ويتذبذب المجالان الكهربائي والمغناطيسي عموديا على اتجاه انتشار الموجات. في حالة الضوء غير القطبي ، تتأرجح هذه الحقول في اتجاهات عديدة. عندما يكون الضوء مستقطبا بشكل دائري ، يتم الحصول على حقلين كهرومغناطيسيين عند اختلاف المرحلة 90 درجة مع بعضهما البعض. تظهر جزيئات Chiral دوران بصري دائري (ثنائية الدوران) بحيث تمتص الضوء المستقطب دائريا الأيمن والضوء المستقطب دائريا الأيسر إلى مدى ^مختلف3. سيتم تتبع الحقل الكهربائي الناتج كقطع ناقص ، وهو دالة الطول الموجي. وبالتالي، يتم تسجيل طيف القرص المضغوط على أنه بيضاوي الشكل (q)، ويتم تقديم البيانات على أنها متوسط بقايا القطع الناقص كدالة للطول الموجي.

في حالة البروتينات ، فإن Cα من الأحماض الأمينية (باستثناء الجليسين) هو chiral ، ويتم استغلال هذا عن طريق التحليل الطيفي للقرص المضغوط لتحديد الهيكل الثانوي لهذا الجزيئات ^{الكبيرة4}. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من جزيئات البروتين في نطاق الأشعة فوق البنفسجية البعيدة. α-البروتينات هيليكال لها اثنين من العصابات السلبية في 222 نانومتر و 208 نانومتر وذروة إيجابية واحدة في 193 ^nm4. تظهر البروتينات ذات البنية الثانوية المضادة لالتوازي β ورقة ذروة سلبية عند 218 نانومتر وذروة إيجابية عند 195 ^{نانومتر4}. البروتينات مع هياكل مضطربة تظهر بيضاوية منخفضة بالقرب من 210 نانومتر وذروة سلبية في 195 ^nm4. وهكذا، فإن الذروة/النطاقات المحددة جيدا لمختلف الهياكل الثانوية تجعل من CD أداة مريحة لتوضيح التغيرات التركيبية التي تحدث في الهيكل الثانوي للبروتينات أثناء التشبع وكذلك الربط الرابط.

الأحماض النووية لديها ثلاثة مصادر من chirality: جزيء السكر، وهتك الهيكل الثانوي، وترتيب الثالثية طويلة المدى من الحمض النووي في ^{البيئة5،6}. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من الأحماض النووية في نطاق 190 إلى 300 ^{نانومتر5،6}. كل تشكيل الحمض النووي، تماما مثل البروتينات، ويعطي طيف مميز، على الرغم من أن القمم / النطاقات يمكن أن تختلف من قبل بعض الدرجات بسبب ظروف المذيبات والاختلافات في تسلسل الحمض ^{النووي7}. يتميز B-DNA ، الشكل الأكثر شيوعا ، بذروة إيجابية حول 260-280 نانومتر وذروة سلبية حول 245 ^nm6. قمم / عصابات من الحمض النووي B-شكل صغيرة عموما لأن أزواج قاعدة عمودي على الحلزون المزدوج، مما يمنح chirality ضعيفة للجزيء. يعطي A-DNA ذروة إيجابية مهيمنة عند 260 نانومتر وذروة سلبية حول 210 ^nm6. Z-DNA، الحلزون أعسر، يعطي الفرقة السلبية في 290 نانومتر وذروة إيجابية حول 260 ^nm6. هذا الحمض النووي يعطي أيضا ذروة سلبية للغاية في 205 ^nm6.

بالإضافة إلى هذه التشكيلات، يمكن أن يشكل الحمض النووي أيضا ثلاثية ورباعية دبابيس شعر، وكلها يمكن تمييزها بالمنظار المضغوط. تعطي رباعية G-quadruplex المتوازية نطاقا إيجابيا مهيمنا عند 260 نانومترا ، في حين أن G-quadruplex المضاد للموازي يعطي نطاقا سلبيا عند 260 نانومترا وذروة إيجابية عند 290 نانومترا ، مما يجعل من السهل التمييز بين شكلي الهياكل ^{الرباعية6}. الثلاثيات لا تعطي الطيف ^{المميز8}. على سبيل المثال، تظهر أطياف الحمض النووي الذي يبلغ طوله 36 نيوكليوتيد مع إمكانية تشكيل حلزون ثلاثي داخل الجزيئي يحتوي على أزواج قاعدة G.G.C و T.A.T في وجود Na⁺ نطاقا سلبيا قويا عند 240 نانومترا وذروة إيجابية واسعة. تظهر الذروة الإيجابية الواسعة المساهمات عند 266 و273 و286 نانومتر. نفس oligonucleotide في وجود نا ⁺ و Zn ⁺ يظهر أربعة نطاقات سلبية (213، 238، 266، و 282 نانومتر) وذروة إيجابية في 258 نانومتر. وبالتالي، يمكن أن تختلف أطياف الحمض النووي الثلاثي وفقا لظروف ^الملح8.

وبالإضافة إلى هذه التشكيلات، مكنت أطياف الأقراص المضغوطة من تحديد شكل آخر من الحمض النووي يسمى X-DNA. يتكون الحمض النووي X عندما يحتوي تسلسل الحمض النووي على بقايا أدينين والثيمين البديلة. تحتوي أطياف القرص المضغوط للحمض النووي X على ذروتين سالبتين عند 250 و 280 نانومتر. معلومات قليلة جدا متاحة حول X-DNA, على الرغم من أنه قد تم التكهن لتعمل بمثابة بالوعة لsupercoiling6,9 إيجابية. التغيرات في أطياف CD يمكن أن تكشف أيضا تفاصيل عن التفاعلات بين البروتين ليغاند، وبالتالي، قد أضيفت إلى ترسانة من الطرق الجزيئية للكشف عن التفاعلات بين المخدرات والبروتين10^{،11،12،13،14}. كما تم استخدام أطياف الأقراص المضغوطة لرصد التغيرات في البنية الثانوية للبروتينات أثناء عملية ^الطي15. وبالمثل، يمكن أيضا استخدام أطياف القرص المضغوط للتحقيق في تفاعلات ligand-DNA16,17.

وبالتالي، فإن التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة هو طريقة سهلة وغير مكلفة للتمييز بين الأشكال المختلفة لتطابق الحمض النووي، شريطة أن يكون هناك إمكانية الوصول إلى معدات وبرامج غير مكلفة. الأسلوب حساس للغاية وسريع. فهو يتطلب فقط كمية صغيرة من الحمض النووي، مما يعطيها ميزة على التقنية البديلة للرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. المعايرة مع الليجاند والركائز هي أيضا سهلة الأداء. القيد الرئيسي هو أن الحمض النووي يجب أن يكون نقيا للغاية. فمن المستحسن استخدام البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (الصفحة) تنقية الحمض النووي.

وقد استخدمت المعلومات التي تم الحصول عليها من أطياف CD بشكل رئيسي لاستقراء السمات الهيكلية للبروتين وتحديد مطابقي الحمض النووي المتميزين. في هذه الدراسة، تم استخدام أطياف CD لدمج النتائج التي تم الحصول عليها من تجربة في الجسم الحي كروماتين المناعي (ChIP) لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة / عامل النسخ المتوقع يمكن أن يحدث تغييرا تشكيليا في المنطقة المروجة لجيناتها التأثيرية. يساعد هذا التعاون في تقدم التقنيات الطيفية التقليدية لمؤتمر نزع السلاح من خلال التنبؤ بآلية تنظيم النسخ من خلال عامل النسخ المتوقع في موقع بدء النسخ وحوله (TSS) للمروج.

Chromatin إعادة عرض هو آلية محددة جيدا معروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي من خلال جعل الكروماتين معبأة بإحكام في متناول مختلف العوامل التنظيمية مثل عوامل النسخ، ومكونات تكرار الحمض النووي، أو البروتينات إصلاح الضرر. إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP ، والمعروفة أيضا باسم عائلة SWI / SNF من البروتينات ، هي بروتينات إعادة تشكيل رئيسية موجودة في الخلايا eukaryotic18^،19. وقد صنفت التجمع النباتي عائلة SWI / SNF من البروتينات إلى 6 مجموعات ^فرعية20: Snf2 مثل، Swr1 مثل، SSO1653 مثل، راد54 مثل، Rad5/16 مثل، وبعيدة. SMARCAL1، البروتين من الفائدة في هذه الدراسة، ينتمي إلى المجموعة الفرعية ^{البعيدة20}. وقد استخدم هذا البروتين للتحقيق في طريقة التنظيم النسخي باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط.

وقد ثبت أن معظم أعضاء البروتينات إعادة عرض الكروماتين تعتمد ATP إما لإعادة وضع أو طرد النيوكليوسومات أو التوسط تبادل البديل الهستون بطريقة تعتمد على ^ATP21,22. ومع ذلك، لم يثبت أن بعض أفراد هذه الأسرة يعيدون تشكيل النيوكليوسومات، مثل SMARCAL1. على الرغم من أن الدراسات قد أظهرت أن SMARCAL1 يرتبط مع كروموسومات البوليتين، الأدلة التجريبية بشأن قدرتها على إعادة تشكيل النوى ^تفتقر23. لذلك ، كان من المسلم به أن SMARCAL1 قد تنظم النسخ عن طريق تغيير تشكيل ^DNA24. وقد وفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة طريقة سهلة وسهلة المنال للتحقق من صحة هذه الفرضية.

SMARCAL1 هو بروتين إعادة عرض الكروماتين المعتمد على ATP الذي يعمل في المقام الأول كهيلية طية25,26,27. وقد افترض لتعديل النسخ عن طريق إعادة عرض تشكيل الحمض ^{النووي24}. لاختبار هذه الفرضية ، تمت دراسة دور SMARCAL1 في تنظيم نسخ الجينات أثناء تلف الحمض النووي الناجم عن الدوكسوروبيسين. في هذه الدراسات، تم استخدام SMARCAL1 لتحليل الجسم الحي وADAAD للمقاسات في ^{المختبر28،29}. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن ADAAD يمكن التعرف على الحمض النووي بطريقة تعتمد على الهيكل ولكن تسلسل ^{مستقل30،31}. يرتبط البروتين على النحو الأمثل بجزيئات الحمض النووي التي تمتلك حبلا مزدوجا إلى مناطق انتقالية ذات حبل واحد ، على غرار الحمض النووي الحلقي الجذعي ، ويتحلل ATP ^30,31.

في تجارب الجسم الحي أظهرت أن SMARCAL1 ينظم التعبير عن MYC، DROSHA، DGCR8، و DICER عن طريق ربط المناطق ^{المروج28،29}. تم تحديد منطقة التفاعل من خلال تجارب ^ChIP28,29. يتم استخدام تقنية ChIP لتحليل تفاعل البروتين مع الحمض النووي cognate داخل الخلية. وهدفها هو تحديد ما إذا كانت بروتينات محددة، مثل عوامل النسخ على المروجين أو مواقع ربط الحمض النووي الأخرى، مرتبطة بمجالات جينومية محددة. البروتين المرتبط بالحمض النووي هو أول مرتبط عبر باستخدام الفورمالديهايد. ويتبع ذلك عزل الكروماتين. يتم قص الكروماتين المعزول إلى شظايا 500 bp إما عن طريق سونيكيشن أو هضم النيوكليز ، ويتم إهلاك البروتين المرتبط بالحمض النووي باستخدام أجسام مضادة خاصة بالبروتين. يتم عكس الربط المتبادل ، ويتم تحليل الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو PCR الكمي في الوقت الفعلي.

أدت نتائج ChIP إلى فرضية أن SMARCAL1 ربما يتوسط تنظيم النسخ من خلال إحداث تغيير تشكيلي في المناطق المروجة لهذه الجينات. واستخدمت برامجيات خرائط QGRS و Mfold لتحديد إمكانات هذه المناطق المروجة لتشكيل هياكل ^{ثانوية28,29}. يستخدم مخطط QGRS للتنبؤ ب G-quadruplexes32، بينما يحلل ^Mfold33 قدرة التسلسل على تشكيل هياكل ثانوية مثل الحلقات الجذعية.

بعد تحليل البنية الثانوية ، تم إجراء المزيد من التجارب في المختبر مع 6X 6X النشطة الموسومة الحمض النووي النشط تعتمد على ATPase A Domain (ADAAD) ، وهو متجانس البقري من SMARCAL1 ، منقى من Escherichia ^coli34. وأجريت اختبارات ATPase باستخدام ADAAD لإثبات أن تسلسل الحمض النووي المحدد يمكن أن يكون بمثابة ^{التأثيرات28,29}. وأخيرا، تم إجراء التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة لرصد التغيرات التوافقية الناجمة في جزيء الحمض النووي من قبل ^ADAAD28,29.

لإثبات أن نشاط ATPase من البروتين كان أساسيا لإحداث تغيير تشكيلي في جزيء الحمض النووي، إما حمض الإيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) تمت إضافته إلى تشيلات Mg ⁺² أو نشط معتمد على الحمض النووي ATPase A مجال المانع Neomycin (ADAADiN)، مثبط محدد للبروتين SWI / SNF، ^{أضيفت 35،36} . يمكن استخدام هذه التقنية الطيفية CD مع أي بروتين منقى تم إثباته من قبل ChIP أو أي مأساء أخرى ذات صلة لربط منطقة الجينوم المتوقعة للمروج.