末梢神経インターフェースのためのワイヤレス、バッテリーレスシステムの移植と制御

このプロトコルに記載されているすべての手順は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに従って実施され、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルは、ノースウェスタン大学の比較医学センターおよびIACUCの動物ケアガイドラインに従います。プロトコルを適応させる際には、IACUCに相談する必要があります。 1. ワイヤレス電子刺激装置の作製(図2) 銅/ポリイミド/銅(厚さ18μmの上下銅、厚さ75μmのポリイミド)を無線周波数パワーハーベスタコイル(ワイヤレス受信アンテナ)の基板として使用します。 直接レーザーアブレーションを使用して、上下の銅層に電極用の穴をパターン化し、デバイスを成形します。上層と下層を銀ペーストで穴に通して電気的に接続します。 ダイオードやコンデンサなどの電子部品を市販のパッケージにはんだ付けで取り付けます。 伸縮性延長電極19には、生体吸収性動的共有結合ポリウレタン(b-DCPU;厚さ200μm)を内包したモリブデン(Mo;厚さ15μm、蛇行構造)を用いる。 デバイスと神経の界面に、ポリ乳酸-グリコール酸-co-グリコール酸(PLGA)フィルム(厚さ300μm)を用いてカフ電極を形成します。 ワイヤレス受信アンテナと伸縮可能な延長電極を接続した後、ワイヤレス受信アンテナと接続部を市販の防水エポキシまたはポリジメチシロキサン(PDMS)で封入します。完全に組み立てられたデバイスについては、 図2 (右)を参照してください。 波形発生器を使用して、一次コイル(つまり、送信コイル)を介して単相性電気インパルスを生成して、デバイスのワイヤレス動作を確認します。注:末梢軸索の動員と単相性および二相性刺激による軸索再生の誘導を調べたところ、以前の研究では、波形特性の違いによる影響は無視できる程度であると報告されており20、このグループは、マウス21 およびラット18において、同じ単相性電流パラメータで治療的電気刺激増強を達成することができた。さらに、以前の研究では、 in vivo および in vitro での生体適合性が調べられており、加熱効果や材料自体による組織損傷の証拠は見つかりませんでした。これらの発見と、本研究における治療的電気刺激の期間が限られているため、このプロトコルでは、二相性ではなく単相性の刺激が使用されました。 得られた直流出力電圧を、カフ電極に接続されたオシロスコープで測定します。 2.移植のためのデバイスの準備 インプラントデバイスを滅菌シャーレに入れ、パラフィルムで密封します。 デバイスに片面30分間UVライトを照射します。 3. ラット右坐骨神経移植による電気刺激用ワイヤレス・電池不要の末梢神経インターフェースの外科的処置(図3) 注意: 無菌状態を維持してください。動物処置室の指定された手術エリア内で手術を行います。外科医は、手術中、フェイスマスク、コート、キャップ、滅菌手袋を着用します。複数回の手術を行う場合は、動物間で滅菌手袋を交換し、手術ごとに清潔で滅菌された手術器具を使用してください。手術の合間には、加熱滅菌(オートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器)で器具を滅菌します。体重200〜250gの成体のSprague-Dawleyラットを使用します。 イソフルランガス麻酔(3%誘導、1〜3%維持)を使用して麻酔を誘発し、酸素(2 L / min)でメロキシカム(1〜2 mg / kg)を皮下投与します。.乾燥を防ぐために、指定された眼科用軟膏でラットの目を覆います。 その後の処置のために、ラットを消毒された手術台の上に腹臥位に置きます。残りの手術期間中は、呼吸数(~2/s)、組織の色、麻酔の深さを15分ごとに評価し、それに応じてイソフルランレベルを維持します。ペダル反射(つま先を強くつまむことへの反応の欠如)をチェックして、適切な麻酔深度を確認します。ピンク色で湿ったままであるはずの粘膜を監視します。 右足と背中の下半分を含む手術部位を剃ります。剃った手術部位をベタジンパッドでこすり、続いて70%医療用エタノール綿棒でこすり、このスクラブプロセスを3回繰り返して皮膚を消毒します。 組織ハサミを使用して右大腿骨と平行に皮膚を1.5〜2cm切開し、続いて背中(切開部の真内側)の皮下結合組織を鈍く分離して、レシーバーコイルの皮下ポケットを取り除きます(図4A)。皮膚切開と平行に右臀筋を切開(1.2〜1.5 cm)します。 先端が鈍い金属製の解剖プローブで坐骨神経を静かに分離します(図4B)。注:坐骨神経は大腿二頭筋の奥深くにあり、大腿骨と平行に走っています。解剖範囲が提案されます。 孤立した右坐骨神経にカフを巻き付けて、神経に緊張をかけたり、その経路を歪めたりすることなく、坐骨神経にワイヤレスのバッテリー不要のデバイスを埋め込みます(図4C)。レシーバーコイルが置かれている皮膚に印を付けて、さらに電気刺激を加えます。 吸収性縫合糸を使用して臀筋切開部を縫合します(図4D)。注意: レシーバーコイルの上半分は臀筋の上にあり、その下のカフインターフェースがあります。 皮膚の切開部を創傷クリップ(または埋設縫合糸; 図4E)。スキンのエッジを一致させます。 麻酔下で、200μsのパルス幅で術後20Hzの電気刺激を1時間連続して行います(図4F)。麻酔から完全に回復した後、動物をホームケージに戻します。メモ: 詳細なプロトコルについては、以下で説明します。レシーバーコイルは、 図4Fの表皮の上に示されています。 術後治療寝具のない回収ケージにラットを入れ、ペーパータオルで裏打ちし、ケージの半分を適切な温度調節熱源(承認された加熱パッド)の上に置きます。 ネズミが歩行可能になるまで注意深く監視します。歩行可能になり、安定していると評価されたら、ラットをホームケージに戻し、社会復帰を待ちます。 急性回復後、ラットの切開部位の感染と、警戒、身悶え、引っ掻き傷、自傷行為などの神経原性疼痛の症状を監視します。術後5日間の回復期間中はラットを毎日監視し、5日目にラットが犠牲にならない場合は、その後少なくとも3日に1回監視します。 メロキシカム(1〜2 mg / kg)を1日1回、手術後2〜3日間皮下投与します。持続的な痛みが疑われる場合は、術後もこの期間を超えてメロキシカムを継続し、難治性であることが判明した場合は、獣医チームと相談してラットを早期に安楽死させます。. 手術後10〜12日で皮膚縫合糸または創傷クリップを取り外します。 4. ラット左横隔神経の無線刺激装置移植手術(図5A) 注意: セクション3のように、無菌状態を維持します。体重200〜250gの成体のSprague-Dawleyラットを使用します。使用前にすべての手術器具を滅菌してください。 イソフルランガス麻酔(3%誘導、1〜3%維持)を使用して麻酔を誘発し、酸素(2 L / min)でメロキシカム(1〜2 mg / kg)を皮下投与します。.乾燥を防ぐために、指定された眼科用軟膏でラットの目を覆います。. その後の処置のために、ラットを消毒された手術台の上に仰臥位に置きます。残りの手術期間中は、呼吸数、組織の色、麻酔の深さを15分ごとに評価し、それに応じてイソフルランレベルを維持します。.ペダル反射(つま先を強くつまむことへの反応の欠如)をチェックして、適切な麻酔深度を確認します。ピンク色で湿ったままであるはずの粘膜を監視します。 首の腹側の手術部位を剃ります。剃った手術部位をベタジンパッドでこすり、続いて70%医療用エタノール綿棒でこすり、このスクラブプロセスを3回繰り返して皮膚を消毒します。 ブピバカイン(2 mg / kg、生理食塩水で希釈して総量0.5mLを超えない)を首の正中線に皮下投与し、最も表層をターゲットにします。.皮膚と表在性頸部筋膜を3cmの正中線切開を行い、胸骨軟骨筋と胸鎖乳突筋を露出させます(図5B)。注:解剖スコープが推奨されます。 プローブによる穏やかな鈍的解剖を使用して胸鎖乳突筋を上昇させ、血管ループを使用して横方向に引っ込めます(図5C)。オモヒオイドを静かに解放し、引っ込めます。次に、迷走神経と舌骨筋の下にある頸動脈束を静かに解放し、内側に引っ込めます。注:ここでの主な違いは、迷走神経と横隔神経の間です。下の構造を露出させる必要がある場合は、オモヒイドをカットします。 横隔神経を分離します(図5D)。注:横隔神経は前斜角筋の表面に沿って走り、腕神経叢に垂直に交差する非常に小さな縦神経として走っています。坐骨神経とは異なり、首の横隔神経の周りの解剖学的構造はより複雑です。最良の結果を得るには、移植前に電気生理学的確認(ステップ4.7)を実行します。 記録電極を皮下、胸郭の尾側、孤立した横隔神経の同側に配置します(図5E)。横隔神経に刺激装置を置き、同期シグナル伝達で確認します(図6)。注:刺激強度が3~6mA、刺激持続時間が0.02msの最大応答が一般的です。 横隔部位に対して近位神経端に電気刺激を加えた場合の誘発反応の完全な消失を示すことにより、横隔神経の完全な離断を確認します(図6)。 横隔神経の周囲にカフを配置し、神経に垂直に配置された接触電極を、両側の胸鎖乳突筋に対して深い胸骨舌骨に埋め込み型デバイスの受信コイルを配置して、横隔神経にワイヤレスのバッテリー不要のデバイスを埋め込みます(図5F)。 表在性頸部筋膜を単純なランニング吸収性縫合糸で閉じます(図5G)。真皮深部の中断された逆吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。動物が麻酔から完全に回復した後にのみ、動物をホームケージに戻してください。 術後治療の場合は、手順3.10に従います。 5. 治療用電気刺激のワイヤレス送達 全身麻酔下のラットに1時間電気刺激を与える。ワイヤレス刺激の場合は、波形/関数発生器(電圧:1-15 Vpp)とオプションのアンプを動物の上に置き、外部誘導コイル(つまり、送信コイル)(5ターンの2次元スパイラルコイル、直径:2 cm)に電力を供給して、埋め込まれた受信コイルとの良好な誘導結合を確保します。単相性の200μsパルスを20Hzで1時間供給します。 電気刺激の送達を検証および定量化するために、前脛骨筋からのCMAPを記録し、刺激電圧を調整して坐骨神経を最大限活性化させます。すべての記録に同心円状の針電極を使用してください。注意: 関数が生成する最大電圧が最大応答を呼び起こすのに不十分な場合は、 amplifier。 6.安楽死 主な方法ケージをCO2 デリバリーチャンバーの下に置き、8〜12 LPM(またはチャンバーサイズに基づく適切な流量)の速度に設定します。ラットの意識不明を監視し、その後、少なくとも1分間呼吸を停止します。. 第 2 の方法子宮頸部脱臼または両側開胸術を行います。