JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Productie van siRNA-geladen lipide nanodeeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat

Published: March 22, 2022
doi:
10.3791/62999
, , , , , ,
1Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering,Hokkaido University, 2JST PRESTO, 3Graduate School of Chemical Sciences and Engineering,Hokkaido University

Summary

Microfluïdische productiemethoden voor lipide nanodeeltjes (LNP) hebben de aandacht getrokken in medicijnafgiftesystemen (DDS’en), waaronder RNA-afgifte. Dit protocol beschrijft de fabricage, LNP (siRNA-loaded LNP) productie en LNP evaluatie processen met behulp van ons originele microfluïdische apparaat genaamd iLiNP.

Abstract

De ontwikkeling van functionele lipide nanodeeltjes (LNP’s) is een van de grootste uitdagingen op het gebied van drug delivery systems (DDS). Onlangs hebben op LNP gebaseerde RNA-afgiftesystemen, namelijk RNA-geladen LNP’s, de aandacht getrokken voor RNA-therapie. In het bijzonder werden mRNA-geladen LNP-vaccins goedgekeurd om COVID-19 te voorkomen, wat leidde tot de paradigmaverschuiving naar de ontwikkeling van nanogeneesmiddelen van de volgende generatie. Voor de op LNP gebaseerde nanogeneesmiddelen is de LNP-grootte een belangrijke factor bij het beheersen van de LNP-biodistributie en LNP-prestaties. Daarom is een nauwkeurige LNP-maatregelingstechniek onmisbaar voor het LNP-productieproces. Hier rapporteren we een protocol voor groottegecontroleerde LNP-productie met behulp van een microfluïdisch apparaat, genaamd iLiNP. siRNA-geladen LNP’s worden ook geproduceerd met behulp van het iLiNP-apparaat en geëvalueerd door in vitro experimenten. Representatieve resultaten worden getoond voor de LNP-grootte, waaronder siRNA-geladen LNP’s, Z-potential, siRNA-inkapselingsefficiëntie, cytotoxiciteit en doelgen-uitschakelingsactiviteit.

Introduction

Lipide nanodeeltje (LNP) is een van de meest gebruikte nanodragers voor RNA-afgiftesystemen. Onlangs zijn mRNA-geladen LNP’s goedgekeurd als vaccins voor de preventie van COVID-191,2,3. Over het algemeen speelt de grootte van LNP een cruciale rol in de prestaties van de biodistributie- en medicijnafgiftesystemen (DDS), inclusief gen-uitschakeling of eiwitexpressie4,5,6. Daarom is een nauwkeurige LNP-groottecontrolemethode vereist voor het LNP-productieproces.

Voor de productie van groottegecontroleerde LNP’s hebben microfluïdische apparaten in de loop der jaren de aandacht getrokken7. In 2018 werd de eerste door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde siRNA-geladen LNP’s (bijv. Onpattro) ontwikkeld met behulp van het microfluïdische apparaat8,9. In de op microfluïdische LNP gebaseerde LNP-productiemethode worden een lipideoplossing en een waterige oplossing afzonderlijk in het microfluïdische apparaat ingebracht en vervolgens in het microkanaal gemengd. Om de mengefficiëntie te verbeteren, is het chaotische mengapparaat gebruikt voor de LNP-productie10,11,12. Het chaotische mixerapparaat maakt het mogelijk om LNP’s van specifieke grootte te produceren.

Een eenvoudig microfluïdisch apparaat, genaamd invasieve lipide nanodeeltjesproductie (iLiNP), uitgerust met bafflestructuren, is ontwikkeld om de LNP-grootte precies te regelen13,14. In vergelijking met het chaotische mixerapparaat was het iLiNP-apparaat in staat om de LNP-grootte te regelen van 20 tot 100 nm met intervallen van 10 nm. Daarnaast produceerde het iLiNP-apparaat siRNA-geladen LNPs6, mRNA-geladen LNPs15, ribonucleoproteïne-geladen LNPs16 en exosoomachtige LNPs17. Het doel van dit artikel is om het fabricage- ensiRNA-geladen LNP-productieproces van het iLiNP-apparaat te introduceren en het LNP-evaluatieproces te beschrijven dat door het iLiNP-apparaat wordt geproduceerd.

Protocol

1. Fabricage van het iLiNP-apparaat OPMERKING: Het iLiNP-apparaat is vervaardigd met behulp van de standaard zachte lithografiemethode18. Het gedetailleerde fabricageprotocol werd eerder gemeld10,13. SU-8 mal fabricage Giet SU-8 3050 op een 3-inch silicium wafer. Spincoat de siliciumwafer om een 100 μm dikke SU-8 laag te verkrijgen. Bak de siliciumwafel door deze gedurende 5 minuten op een kookplaat bij 65 °C en 45 min op een kookplaat te leggen. Plaats na het bakken de siliciumwafer op het podium van een desktopmaskerloos lithografiesysteem. Stel de siliciumwafer bloot aan UV-licht bij 365 nm gedurende 1,5 s per positie.OPMERKING: In dit experiment werd een desktopmaskerloos lithografiesysteem gebruikt. Het systeem stelt automatisch UV-licht bloot op een verdeeld bestralingsgebied (één positie) van het microkanaal. Bak na UV-straling de siliciumwafel op de kookplaat op 65 °C gedurende 1 min en 95 °C gedurende 5 minuten. Koel de siliciumwafer af en laat vervolgens 15 minuten in een SU-8-ontwikkelaar weken om onbelichte SU-8 te verwijderen. Behandel de SU-8-mal met een trichloorm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan met behulp van een exsiccator en vacuümpomp. Fabricage van het iLiNP-apparaat Meng de siliconenbasis en het uithardingsmiddel van polydimethylsiloxaan (PDMS) in een verhouding van 10:1 (w/w). Ontgas het mengsel met behulp van een vacuümpomp en een exsiccator.OPMERKING: PDMS werd ontgast met behulp van een vacuümpomp gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Giet de ontgaste PDMS op de SU-8 vorm in een petrischaaltje van 100 mm met een dikte van 0,5 tot 1 cm, gevolgd door het bakken in een oven op 80 °C gedurende 1 uur. Koel de mal af en schil vervolgens het PDMS-substraat uit de SU-8-mal met een pincet. Pons drie gaten (0,5 mm) in het PDMS-substraat. Bind het PDMS-substraat en een glasplaat met behulp van een zuurstofplasmareiniger om een iLiNP-apparaat te bouwen (zie figuur 1)13. Sluit drie PEEK-haarvaten (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) aan op de in- en uitlaat van het iLiNP-apparaat en hard uit met een secondelijm.OPMERKING: De lengte van de PEEK-haarvaten is instelbaar en afhankelijk van het experiment. 2. Bereiding van lipide-oplossingen Bereid lipide/ethanoloplossingen voor: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropaan (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleenglycol-2000 (DMG-PEG2k) en 20 mM cholesterol. Bewaar de stamoplossingen vóór het experiment bij -20 °C. Om de siRNA-geladen LNP’s te produceren, meng DOTAP, DSPC, cholesterol en DMG-PEG2k-oplossingen in een molaire verhouding van 50/10/38.5/1.5. De totale lipidenconcentratie wordt aangepast tot 8 mM. 3. Bereiding van waterige oplossingen Bereid waterige oplossingen voor: 154 mM NaCl (zoutoplossing), 25 mM acetaatbuffer bij pH 4,0 met DNase/RNase-vrij gedestilleerd water. Filter de oplossingen door membraanfilters van 0,2 μm of spuitfilters. 4. Bereiding van de siRNA/bufferoplossing Los 70 μg siGL4 op in 1 ml acetaatbuffer van 25 mM (pH 4,0).OPMERKING: siGL4 wordt gebruikt voor de knockdown van luciferase gen. 5. Opzetten van het iLiNP-apparaat en productie van LNP’s OPMERKING: Zie figuur 1 voor de schema’s. Vul glazen spuiten van 1 ml met lipide- en waterige oplossingen (van respectievelijk stap 3.1 en 4.1 in afzonderlijke spuiten).OPMERKING: Pas het volume lipide en waterige oplossing aan, afhankelijk van de hoeveelheid die nodig is voor het LNP-evaluatie-experiment. Sluit de glazen spuiten aan op de PEEK-haarvaten met behulp van spuitconnectoren. Stel de stroomsnelheid van de lipide- en waterige oplossingen in.OPMERKING: De stroomsnelheidsverhouding (FRR) van de waterige fase tot de lipidefase varieert van 3:1 tot 9:1. Breng de lipide- en waterige oplossingen afzonderlijk in het iLiNP-apparaat met behulp van spuitpompen. Verzamel LNP-suspensies in een microbuis uit de uitlaat van het iLiNP-apparaat (figuur 1). 6. Dialyse van de LNP-suspensie en LNP-maatmeting Dialyseer de LNP-suspensie met behulp van een dialysemembraan (12−14 kDa MW cutoffs) bij 4 °C ‘s nachts tegen zoutoplossing of D-PBS voor respectievelijk POPC LNP’s en siRNA-geladen LNP’s.OPMERKING: POPC wordt niet opgelost in zoutoplossing (zie 2.1). POPC/ethanoloplossing wordt verdund met zoutoplossing in het iLiNP-apparaat. Verzamel de gedialyseerde LNP-suspensies in microbuisjes. Pipetteer 20-30 μL van de LNP-suspensie naar een microkwartscel. Meet de LNP-grootte, LNP-grootteverdeling en polydispersiteitsindex door DLS (Dynamic Light Scattering). 7. Meting van de Z-potentiaal van de LNP OPMERKING: Voor de meting van Z-potentiaal werd een deeltjesanalysator (zie Materiaaltabel) gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Verdun de LNP-suspensie verkregen uit stap 6.1 35 keer met 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4). Pipetteer 700 tot 1000 μL van de verdunde LNP-suspensie naar een capillaire cel. Meet de Z-potentiaal volgens de instructies van de fabrikant. 8. siRNA-inkapselingsefficiëntie door RiboGreen-assay OPMERKING: Ribogreen assay wordt uitgevoerd om de siRNA-inkapseling in LNPs19 te evalueren. Ribogreen assay kan de hoeveelheid RNA’s binnen en buiten LNP’s meten met / zonder een oppervlakteactieve stof (bijv. TritonX-100). Verdun 2 mg/ml siGL4 met 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) tot 500 ng/ml siGL4-oplossing. Bereid de verdunningsreeks (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/ml) van de siGL4-oplossing voor om een kalibratiecurve te maken voor Triton-monsters (+) en Triton-monsters (-). Verdun de LNP-suspensie 100 keer met 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4). Meng het volgende voor Triton (+) oplossing: 980 μL van 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 μL van 10% w/v TritonX-100 en 1,25 μL RiboGreen voor 10 putjes van een 96-well microplaat. Meng het volgende voor Triton (-) oplossing: 1000 μL van 10 mM HEPES (pH 7,4) en 1,25 μL RiboGreen voor 10 putjes van een 96-well microplaat. Pipetteer 100 μL van de verdunningsreeks van siGL4-oplossing en verdunde LNP-suspensies in de putten van een zwarte 96-well microplaat.OPMERKING: De verdunningsreeks van siGL4-oplossing en verdunde LNP-suspensies werden in vier microwells per conditie gedoseerd. Pipetteer 100 μL van de detectieoplossing (TritonX-100 (+) of Triton (-)) in de putten.OPMERKING: De detectieoplossing (TritonX-100 (+)) werd in twee putjes per monster per conditie gedoseerd en de TritonX-100 (-) oplossing werd in de resterende twee putten per monsterconditie gedoseerd. Incubeer de microplaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van een microplaatlezer op een golflengte van 475 nm. Bereken de siRNA-inkapselingsefficiëntie uit de volgende vergelijking19. 9. Celkweek Bereid een groeimedium voor met DMEM, warmte-geïnactiveerde 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine en 400 μg / ml G418. Kweek HeLa-cellen die stabiel vuurvlieg en Renilla luciferase (HeLa-dluc) tot expressie brengen in een 100 mm TC-behandelde celkweekschaal met het groeimedium bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . 10. Test van de levensvatbaarheid van cellen Zaad 100 μL van een suspensie van HeLa-cellen in het groeimedium (6 x 103 cellen/put) in een 96-well microplaat.OPMERKING: Cellen werden geteld met behulp van een celtellerplaat en een microscoop. Incubeer de microplaat gedurende 24 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Verdun de siRNA-geladen LNP’s met DMEM (FBS (-)) in de concentraties van 10 en 100 nM siRNA’s. Doseer 100 μL van de verdunde siRNA-geladen LNP-suspensie per put. Incubeer de microplaat gedurende 4 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Verwijder de LNP-suspensie en voeg 100 μL DMEM (FBS (+)) toe. Incubeer de microplaat gedurende 20 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Meet de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.OPMERKING: D-PBS (-) werd gebruikt als de negatieve controle. 11. Luciferase gen knockdown assay Zaad 75 μL van een suspensie van HeLa-cellen in het groeimedium (4,5 x 103 cellen/put) in een 96-well microplaat. Incubeer de microplaat gedurende 24 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Verdun de siRNA-geladen LNP’s met DMEM (FBS (-)) in de concentraties van 10 en 100 nM siRNA’s. Doseer 75 μL van de verdunde siRNA-geladen LNP-suspensie per put. Incubeer de microplaat gedurende 4 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Verwijder de LNP-suspensie en voeg 75 μL DMEM (FBS (+)) toe. Incubeer de microplaat gedurende 20 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Meet de luciferase-expressie met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.OPMERKING: We hebben D-PBS (-) gebruikt als de negatieve controle.

Representative Results

Figuur 2A,B toont de POPC LNP-grootteverdeling geproduceerd bij verschillende stroomomstandigheden. De op microfluïdische basis gebaseerde LNP-bereidingsmethode kan de grootte van LNP’s regelen door de stroomomstandigheden zoals het totale debiet (TFR) en de FRR. Vergeleken met de typische microfluïdische apparaten, waaronder het chaotische mixerapparaat en het flow-focusing microfluïdische apparaat, maakte het iLiNP-apparaat nauwkeurige LNP-grootteregeling mogelijk, variërend van 20 tot 100 nm (figuur 2). Kleine LNP’s vormden zich bij hoge totale debietomstandigheden. Bovendien waren de LNP-maten gevormd bij de FRR van 5 kleiner dan die van de FRR van 3, ongeacht het totale debiet13. siRNA-geladen LNP’s werden ook bereid met behulp van het iLiNP-apparaat (figuur 3A). Voor het siRNA-geladen LNP-preparaat werd DOTAP, een kationisch lipide, gebruikt om het siRNA effectief in de LNP’s in te kapselen. Het iLiNP-apparaat produceerde 90 nm grote siRNA-geladen kationische LNP’s met een smalle verdeling (figuur 3A,B). De siRNA-inkapselingsefficiëntie was 95% vanwege de elektrostatische interactie tussen het kationische lipide en negatief geladen siRNA’s (figuur 3C). Cytotoxiciteit en de gen-uitschakelingsactiviteit van 90 nm siRNA-geladen LNP’s werden geëvalueerd zoals weergegeven in figuur 4 en figuur 5. siRNA-geladen LNP’s vertoonden cytotoxiciteit bij een dosis van 10 en 100 nM siRNA. We bevestigden ook dat het expressieniveau van luciferase afnam afhankelijk van de siRNA-concentratie. De siRNA-geladen LNP’s onderdrukten 80% luciferase-expressie bij een dosis van 100 nM siRNA. Het effect van LNP-grootte op de gen-uitschakelingsactiviteit werd eerder gemeld6,13,17. Figuur 1: (A) Schematische illustratie en (B) foto van het iLiNP-apparaat. Het iLiNP-apparaat bestaat uit PDMS en glassubstraten. Het iLiNP-apparaat is verbonden met PEEK-haarvaten met een secondelijm. De lipide- en siRNA/bufferoplossingen worden afzonderlijk in het iLiNP-apparaat geïntroduceerd met behulp van spuitpompen. De LNP-suspensie wordt opgevangen in een microbuisje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: POPC LNP-grootteverdelingen geproduceerd door het iLiNP-apparaat bij de verschillende stroomsnelheidsverhoudingen (FRR). De POPC LNP-grootte wordt gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS). De POPC LNP’s worden voorbereid door het totale debiet en de FRR te wijzigen: (A) 3 FRR en (B) 5 FRR. Kleine LNP’s worden gevormd bij hoge totale debietomstandigheden. Bovendien waren de LNP-maten gevormd bij de FRR van 5 kleiner dan die bij de FRR van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Karakterisering van de siRNA-geladen LNP’s. (A) Grootteverdeling van siRNA-geladen LNP’s. siRNA’s (siGL4) worden ingekapseld in de LNP’s door elektrostatische interactie tussen het kationische lipide (DOTAP) en negatief geladen siRNA’s. (B) Z-potentiaal van de siRNA-geladen LNP’s. De LNP-suspensie werd vóór de meting verdund met 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (standaarddeviatie). n = 3. (C) siRNA-inkapselingsefficiëntie van de op DOTAP gebaseerde LNP’s. De inkapselingsefficiëntie werd bepaald door ribogreen assay. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Cytotoxiciteit van de siRNA-geladen LNP’s. siRNA-geladen LNP’s werden verdund met DMEM (FBS (-)) om de siGL4-concentraties van 10 en 100 nM te verkrijgen. De LNP-suspensies worden toegevoegd aan HeLa-dLuc-cellen en gedurende 4 uur bij 37 °C geïncubeerd in een 5% CO2-incubator . N.T.: Niet-behandeld (D-PBS(-)). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Luciferase gen knockdown activiteit behandeld met siRNA-geladen LNP’s. siRNA-geladen LNP’s worden bereid op dezelfde manier als cel levensvatbaarheidstest. Het luciferase expressieniveau wordt gemeten met behulp van Dual-Glo Luciferase Assay System. N.T.: Niet-behandeld (D-PBS(-)). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De LNP-grootte beïnvloedt de LNP-biodistributie, het antitumoreffect en de gen-uitschakelingsprestaties. Daarom is de LNP-groottecontrolemethode een belangrijke techniek voor het produceren van DDS-nanogeneesmiddelen, inclusief RNA-afgiftesystemen. Het doel van dit artikel is om het iLiNP-apparaat te introduceren voor nauwkeurige maatafstemming van LNP’s en de toepassing ervan op de siRNA-geladen LNP-productie. Het iLiNP-apparaat was in staat om de LNP-grootte te regelen varieerde van 20 tot 100 nm (figuur 2)13. Wanneer de stroomomstandigheden, zoals het totale debiet en de FRR, worden gewijzigd om de LNP-grootte te regelen, moet de LNP-suspensie na ongeveer 5 tot 10 s worden verzameld om de oplossingsstroom te stabiliseren. De LNP-suspensie die uit de uitlaat van het iLiNP-apparaat werd verzameld, werd onmiddellijk tegen de bufferoplossing gedialyseerd om ethanol te verwijderen en LNP-aggregatie te voorkomen.

De LNP size control is een van de grootste uitdagingen op het gebied van DDS. Over het algemeen heeft het conventionele LNP-productieproces, zoals de lipidefilmhydratatiemethode, een maatafstemmingsproces nodig na de LNP-productie20. Aan de andere kant kan de op microfluïdische LNP’s gebaseerde productiemethode de groottegecontroleerde LNP’s produceren door de lipide- en waterige oplossingen in het microfluïdische apparaat te introduceren6,11,13. Hoewel het dialyseproces nodig is om ethanol uit de LNP-suspensie te verwijderen, belooft een continu proces door het microfluïdische apparaat in combinatie met het tangentiële stroomsysteem de automatisering van het LNP-productieproces14. Volgens de literatuur waren de POPC LNP-maten respectievelijk 50-60 nm en 30-60 nm, voor respectievelijk het flow-focusing microfluïdische apparaat21 en het chaotische mixerapparaat10. In vergelijking met andere microfluïdische apparaten maakt het iLiNP-apparaat de POPC LNP-grootteregeling mogelijk in een breed bereik van 20 tot 100 nm.

Het fabricageproces van het gebruikte iLiNP-apparaat was de standaard zachte lithografie. Zo kan het iLiNP-apparaat in massa worden geproduceerd door middel van rapid prototyping-techniek en kruisbesmetting van oplossingen voorkomen door een wegwerpapparaat te gebruiken. Het iLiNP-apparaat kan siRNA-geladen LNP’s produceren op dezelfde manier als de POPC LNP-productiemethode. Voor de LNP-productiemethode met behulp van het iLiNP-apparaat heeft de gebruiker geen ingewikkelde procedures nodig. Om deze redenen zal de op microfluïdische basis gebaseerde LNP-productiemethode, inclusief het iLiNP-apparaat, naar verwachting worden gebruikt als de standaard LNP-productiemethode. Het protocol van dit artikel kan worden aangepast aan andere microfluïdische apparaten voor LNP-productie. Daarnaast wordt de productie van mRNA-geladen LNP’s ook mogelijk gemaakt door de siRNA/bufferoplossing te veranderen in een bufferoplossing die mRNA’s bevat.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, de speciale onderwijs- en onderzoekskosten van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 en Iketani Science and Technology Foundation.

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) NOF Corp. MC-6081
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) NOF Corp. GM-020
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) NOF Corp. CL-8181TA
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) NOF Corp. MC-8080
10 x D-PBS (-) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 048-29805
Acetic acid FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 017-00251
CellTiter-Blue Cell Viability Assay Promega G8081
cholesterol Sigma-Aldrich C8667-5G
Desktop maskless lithography system NEOARK CORPORATION DDB-701-DL4
Dialysis membrane Repligen 132697
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Lot: 42G6587K
G418 Nacalai Tesque 08973-14
Glass substrate Matsunami Glass Ind., Ltd. S1111
Glass syringe Hamilton GASSTIGHT 1002
HeLa cell HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University
HEPES FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 342-01375
Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6046-500ML
Oxygen plasma cleaner Femto Science CUTE-1MP/R
Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) Thermo Fisher Scientific 15140122
Quant-iT RiboGreen RNA Reagent Thermo Fisher Scientific R11491
siGL4 Hokkaido System Science Co., Ltd The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT
-3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT
-3', respectively.
Silicon wafer GTC
SILPOT 184 W/C (PDMS) Dow Corning Toray Co., Ltd. silicone base and curing agent are included
Sodium acetate FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 192-01075
Sodium chloride FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 191-01665
SU-8 3050 Nippon Kyaku Co., Ltd.
Syringe connector Institute of microchemical Technology Co., Ltd. ISC-011
Syringe pump Chemyx CX07200
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977015
Zetasizer Nano ZS  Malvern Instruments ZEN3600
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586 (2021).
  2. Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
  3. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  4. Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
  5. Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
  6. Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
  7. Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
  8. Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
  9. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
  10. Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962 (2017).
  11. Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, 37 (2012).
  13. Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
  14. Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
  15. Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
  16. Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
  17. Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
  18. Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
  19. Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
  20. Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
  21. Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).

Tags

SiRNALipid NanoparticlesMicrofluidic DeviceSize ControlBiodistributionGene SilencingMRNARibonucleoproteinDOTAPDSPCCholesterolDMG-PEG2kSalineAcetate BufferSiGL4Dynamic Light ScatteringFlow RateFlow Rate Ratio

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maeki, M., Okada, Y., Uno, S., Niwa, A., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (181), e62999, doi:10.3791/62999 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image