إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال (siRNA) باستخدام جهاز الموائع الدقيقة
Summary
جذبت طرق إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية القائمة على الموائع الدقيقة (LNP) الانتباه في أنظمة توصيل الأدوية (DDSs) ، بما في ذلك تسليم الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول عمليات التصنيع وإنتاج LNP (LNP المحمل بواسطة siRNA) وعمليات تقييم LNP باستخدام جهاز الموائع الدقيقة الأصلي المسمى iLiNP.
Abstract
يعد تطوير الجسيمات النانوية الدهنية الوظيفية (LNPs) أحد التحديات الرئيسية في مجال أنظمة توصيل الأدوية (DDS). في الآونة الأخيرة ، جذبت أنظمة توصيل الحمض النووي الريبي القائمة على LNP ، أي LNPs المحملة بالحمض النووي الريبي الانتباه إلى علاج الحمض النووي الريبي. وعلى وجه الخصوص، تمت الموافقة على لقاحات LNP المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال للوقاية من كوفيد-19، مما أدى إلى تحول نموذجي نحو تطوير الجيل التالي من الأدوية النانوية. بالنسبة للأدوية النانوية القائمة على LNP ، يعد حجم LNP عاملا مهما في التحكم في التوزيع الحيوي LNP وأداء LNP. لذلك ، لا غنى عن تقنية التحكم الدقيق في حجم LNP لعملية إنتاج LNP. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول لإنتاج LNP يتم التحكم فيه بالحجم باستخدام جهاز microfluidic ، يسمى iLiNP. يتم أيضا إنتاج LNPs المحملة ب siRNA باستخدام جهاز iLiNP ويتم تقييمها من خلال تجربة في المختبر . يتم عرض النتائج التمثيلية لحجم LNP ، بما في ذلك LNPs المحملة ب siRNA ، وإمكانات Z ، وكفاءة تغليف siRNA ، والسمية الخلوية ، ونشاط إسكات الجينات المستهدفة.
Introduction
الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) هي واحدة من أكثر الناقلات النانوية استخداما على نطاق واسع لأنظمة توصيل الحمض النووي الريبي. في الآونة الأخيرة ، تمت الموافقة على LNPs المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال كلقاحات للوقاية من COVID-191,2,3. بشكل عام ، يلعب حجم LNP دورا حاسما في أداء أنظمة التوزيع الحيوي وتوصيل الأدوية (DDS) ، بما في ذلك إسكات الجينات أو التعبير عن البروتين4،5،6. لذلك ، هناك حاجة إلى طريقة دقيقة للتحكم في حجم LNP لعملية إنتاج LNP.
لإنتاج LNPs التي يتم التحكم فيها في الحجم ، جذبت أجهزة الموائع الدقيقة الانتباه على مر السنين 7. في عام 2018 ، تم تطوير أول LNPs محملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال (siRNA) المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) (على سبيل المثال ، Onpattro) باستخدام جهاز الموائع الدقيقة8,9. في طريقة إنتاج LNP القائمة على الموائع الدقيقة ، يتم إدخال محلول دهني ومحلول مائي بشكل منفصل في جهاز الموائع الدقيقة ، ثم يتم خلطهما في القناة الدقيقة. لتعزيز كفاءة الخلط ، تم استخدام جهاز الخلاط الفوضوي لإنتاج LNP 10،11،12. يتيح جهاز الخلاط الفوضوي إنتاج LNPs بحجم محدد.
تم تطوير جهاز ميكروفلويديك بسيط ، يسمى إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية الغازية (iLiNP) ، مجهز بهياكل محيرة ، للتحكم في حجم LNP بدقة13,14. بالمقارنة مع جهاز الخلاط الفوضوي ، تمكن جهاز iLiNP من التحكم في حجم LNP الذي يتراوح من 20 إلى 100 نانومتر على فترات 10 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، أنتج جهاز iLiNP LNPs 6 المحملة ب siRNA ، و LNPs15 المحملة بالحمض النووي الريبي ، و LNPs16 المحملة بالبروتين الريبي ، و LNPs17 الشبيهة بالإكسوسوم. الهدف من هذه الورقة هو تقديم عملية إنتاج LNP المحملة بالتصنيع و siRNA لجهاز iLiNP ووصف عملية تقييم LNP التي ينتجها جهاز iLiNP.
Protocol
Representative Results
Discussion
يؤثر حجم LNP على التوزيع الحيوي LNP ، والتأثير المضاد للورم ، وأداء إسكات الجينات. لذلك ، فإن طريقة التحكم في حجم LNP هي تقنية مهمة لإنتاج الأدوية النانوية DDS ، بما في ذلك أنظمة توصيل الحمض النووي الريبي. الهدف من هذه الورقة هو تقديم جهاز iLiNP لضبط الحجم الدقيق ل LNPs وتطبيقه على إنتاج LNPs المحملة ب siRNA. كان جهاز iLiNP قادرا على التحكم في حجم LNP تراوح من 20 إلى 100 نانومتر (الشكل 2)13. عندما يتم تغيير ظروف التدفق ، مثل معدل التدفق الكلي و FRR للتحكم في حجم LNP ، يجب جمع تعليق LNP بعد حوالي 5 إلى 10 ثوان لتحقيق الاستقرار في تدفق المحلول. تم وضع تعليق LNP الذي تم جمعه من مخرج جهاز iLiNP على الفور مقابل محلول المخزن المؤقت لإزالة الإيثانول ومنع تجميع LNP.
يعد التحكم في حجم LNP أحد التحديات الرئيسية في مجال DDS. بشكل عام ، تحتاج عملية إنتاج LNP التقليدية ، مثل طريقة ترطيب فيلم الدهون ، إلى عملية ضبط الحجم بعد إنتاج LNP 20. من ناحية أخرى ، يمكن لطريقة إنتاج LNPs القائمة على الموائع الدقيقة إنتاج LNPs التي يتم التحكم فيها بالحجم عن طريق إدخال المحاليل الدهنية والمائية في جهاز الموائع الدقيقة6،11،13. على الرغم من أن عملية غسيل الكلى مطلوبة لإزالة الإيثانول من تعليق LNP ، إلا أن العملية المستمرة بواسطة جهاز الموائع الدقيقة إلى جانب نظام التدفق العرضي تعد بأتمتة عملية إنتاج LNP 14. وفقا للأدبيات ، كانت أحجام POPC LNP 50-60 نانومتر و 30-60 نانومتر ، لجهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق 21 وجهاز الخلاط الفوضوي ، على التوالي 10. بالمقارنة مع أجهزة الموائع الدقيقة الأخرى ، يتيح جهاز iLiNP التحكم في حجم POPC LNP في نطاق واسع من 20 إلى 100 نانومتر.
كانت عملية تصنيع جهاز iLiNP المستخدمة هي الطباعة الحجرية الناعمة القياسية. وبالتالي ، يمكن إنتاج جهاز iLiNP بكميات كبيرة بواسطة تقنية النماذج الأولية السريعة ومنع التلوث المتبادل للحلول باستخدام جهاز يمكن التخلص منه. يمكن لجهاز iLiNP إنتاج LNPs المحملة ب siRNA بنفس طريقة إنتاج POPC LNP. بالنسبة لطريقة إنتاج LNP باستخدام جهاز iLiNP ، لا يحتاج المستخدم إلى أي إجراءات معقدة. لهذه الأسباب ، من المتوقع استخدام طريقة إنتاج LNP القائمة على الموائع الدقيقة ، بما في ذلك جهاز iLiNP ، كطريقة إنتاج LNP القياسية. يمكن تكييف بروتوكول هذه الورقة مع أجهزة الموائع الدقيقة الأخرى لإنتاج LNP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا تمكين إنتاج LNPs المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال عن طريق تغيير حل siRNA / المخزن المؤقت إلى محلول عازل يحتوي على mRNAs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل JST و CREST Grant Number JPMJCR17H1 و Japan و JST و PRESTO Grant Number JPMJPR19K8 و Japan و JST و SCORE واليابان ونفقات التعليم الخاص والبحث من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا و JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 ومؤسسة Iketani للعلوم والتكنولوجيا.
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | NOF Corp. | MC-6081 | |
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) | NOF Corp. | GM-020 | |
| 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) | NOF Corp. | CL-8181TA | |
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) | NOF Corp. | MC-8080 | |
| 10 x D-PBS (-) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 048-29805 | |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 017-00251 | |
| CellTiter-Blue Cell Viability Assay | Promega | G8081 | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667-5G | |
| Desktop maskless lithography system | NEOARK CORPORATION | DDB-701-DL4 | |
| Dialysis membrane | Repligen | 132697 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | Lot: 42G6587K | |
| G418 | Nacalai Tesque | 08973-14 | |
| Glass substrate | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1111 | |
| Glass syringe | Hamilton | GASSTIGHT 1002 | |
| HeLa cell | HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University | ||
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 342-01375 | |
| Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | |
| Oxygen plasma cleaner | Femto Science | CUTE-1MP/R | |
| Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
| siGL4 | Hokkaido System Science Co., Ltd | The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectively. |
|
| Silicon wafer | GTC | ||
| SILPOT 184 W/C (PDMS) | Dow Corning Toray Co., Ltd. | silicone base and curing agent are included | |
| Sodium acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 192-01075 | |
| Sodium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 191-01665 | |
| SU-8 3050 | Nippon Kyaku Co., Ltd. | ||
| Syringe connector | Institute of microchemical Technology Co., Ltd. | ISC-011 | |
| Syringe pump | Chemyx | CX07200 | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments | ZEN3600 |
References
- Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586 (2021).
- Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
- Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
- Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
- Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
- Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
- Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962 (2017).
- Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, 37 (2012).
- Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
- Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
- Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
- Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
- Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
- Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
- Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
- Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
- Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).
