ייצור חלקיקי שומנים טעונים siRNA באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

1. ייצור מכשיר iLiNP הערה: התקן iLiNP מפוברק בשיטת הליתוגרפיה הרכה הסטנדרטית18. פרוטוקול הייצור המפורט דווח בעבר 10,13. ייצור עובש SU-8 יוצקים SU-8 3050 על רקיק סיליקון 3 אינץ ‘. יש לטוות את רקיק הסיליקון כדי להשיג שכבת SU-8 בעובי 100 מיקרומטר. אופים את רקיק הסיליקון על ידי הצבה על פלטה חשמלית בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר האפייה, מניחים את רקיק הסיליקון על הבמה של מערכת ליטוגרפיה ללא מסכה שולחנית. לחשוף את רקיק הסיליקון לאור UV ב 365 ננומטר עבור 1.5 שניות לכל עמדה אחת.הערה: בניסוי זה נעשה שימוש במערכת ליטוגרפיה ללא מסיכה שולחנית. המערכת חושפת באופן אוטומטי אור UV באזור הקרנה מחולק (מיקום אחד) של המיקרו-ערוצים. לאחר הקרנת UV, אופים את רקיק הסיליקון על הכיריים ב 65 °C (65 °F) במשך 1 דקות ו 95 °C (5 °F) במשך 5 דקות. מצננים את רקיק הסיליקון, ולאחר מכן משרים מפתח SU-8 למשך 15 דקות כדי להסיר SU-8 שלא נחשף. טפלו בעובש SU-8 בעזרת סילאן מסוג טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) באמצעות מייבש ומשאבת ואקום. ייצור של התקן iLiNP ערבבו את בסיס הסיליקון ואת חומר הריפוי פולידימתילסילוקסן (PDMS) ביחס של 10:1 (w/w). מורידים את התערובת באמצעות משאבת ואקום ומייבש.הערה: PDMS היה degassed באמצעות משאבת ואקום במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את PDMS degassed על תבנית SU-8 בצלחת פטרי 100 מ”מ עד 0.5 עד 1 ס”מ עובי, ואחריו אפייה בתנור ב 80 °C (80 °F) במשך 1 שעות. מצננים את התבנית, ולאחר מכן מקלפים את מצע PDMS מתבנית SU-8 באמצעות פינצטה. ניקוב שלושה חורים (0.5 מ”מ) במצע PDMS. קשרו את מצע ה-PDMS ואת שקופית הזכוכית באמצעות מנקה פלזמת חמצן לבניית התקן iLiNP (ראו איור 1)13. חברו שלושה נימי PEEK (מזהה 0.3 מ”מ, מנת יתר 0.5 מ”מ) למפרצונים ולשקע של התקן iLiNP ורפאו באמצעות דבק-על.הערה: אורך נימי PEEK ניתן לכוונון ותלוי בניסוי. 2. הכנת פתרונות שומנים בדם הכן פתרונות שומנים בדם/אתנול: 13.4 מ”מ 1-פלמיטויל-2-אולואיל-sn-גליצרו-3-פוספוצוצולין (POPC), 10 מ”מ 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 20 מ”מ 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2k), ו 20 מ”מ כולסטרול. אחסן את פתרונות המלאי בטמפרטורה של -20 °C לפני הניסוי. כדי לייצר את ה-LNPs הטעונים ב-siRNA, יש לערבב את פתרונות DOTAP, DSPC, כולסטרול ו-DMG-PEG2k ביחס טוחן של 50/10/38.5/1.5. ריכוז השומנים הכולל מותאם ל 8 מ”מ. 3. הכנת פתרונות מימיים הכן פתרונות מימיים: 154 mM NaCl (מלוחים), 25 מ”מ מאגר אצטט ב pH 4.0 באמצעות מים מזוקקים ללא DNase / RNase. סנן את הפתרונות באמצעות מסנני ממברנה בגודל 0.2 מיקרומטר או מסנני מזרק. 4. הכנת פתרון siRNA/ חיץ להמיס 70 מיקרוגרם של siGL4 לתוך 1 מ”ל של 25 mM מאגר אצטט (pH 4.0).הערה: siGL4 משמש עבור נוקאאוט של הגן לוציפראז. 5. הגדרת התקן iLiNP וייצור של LNPs הערה: ראו איור 1 לשרטוטים. מלא מזרקי זכוכית 1 מ”ל עם שומנים בדם ופתרונות מימיים (משלבים 3.1 ו 4.1 במזרקים בודדים), בהתאמה.הערה: התאם את נפח השומנים ואת נפח הפתרון מימית בהתאם לכמות הנדרשת עבור ניסוי הערכת LNP. חבר את מזרקי הזכוכית לנימי PEEK באמצעות מחברי מזרק. הגדר את קצב הזרימה של השומנים ופתרונות מימיים.הערה: יחס קצב הזרימה (FRR) של השלב מימי לשלב השומנים נע בין 3:1 ל 9:1. הצג את השומנים ואת פתרונות מימית בנפרד לתוך מכשיר iLiNP באמצעות משאבות מזרק. אסוף מתלים מסוג LNP במיקרו-טיוב מהשקע של מכשיר iLiNP (איור 1). 6. דיאליזה של השעיית LNP ומדידת גודל LNP Dialyze ההשעיה LNP באמצעות קרום דיאליזה (12−14 kDa MW ניתוקים) ב 4 °C (66 °F) בלילה נגד מלוחים או D-PBS עבור POPC LNPs ו- LNPs טעון siRNA, בהתאמה.הערה: POPC אינו מומס לתוך תמיסת מלח (ראה 2.1). פתרון POPC/אתנול מדולל עם תמיסת מלח במכשיר iLiNP. לאסוף את ההשעיות LNP דיאליז במיקרו-צינוריות. פיפטה 20-30 μL של השעיית LNP לתא מיקרו קוורץ. מדוד את גודל ה- LNP, התפלגות גודל LNP ואינדקס הפולידיספרסיה על-ידי פיזור אור דינמי (DLS). 7. מדידת פוטנציאל Z של LNP הערה: למדידת פוטנציאל Z, נעשה שימוש במנתח חלקיקים (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן. לדלל את ההשעיה LNP שהתקבלה משלב 6.1, 35 פעמים עם 10 mM HEPES חוצץ (pH 7.4). פיפטה 700 עד 1000 μL של השעיית LNP מדולל לתא נימי. מדוד את פוטנציאל ה- Z בהתאם להוראת היצרן. 8. יעילות אנקפסולציה siRNA על ידי RiboGreen assay הערה: בדיקת ריבוגרין מבוצעת כדי להעריך את אנקפסולציית siRNA לתוך LNPs19. בדיקת ריבוגרין יכולה למדוד את כמות ה- RNAs בתוך ומחוץ ל- LNPs עם / ללא פעילי שטח (למשל, TritonX-100). לדלל 2 מ”ג / מ”ל של siGL4 עם 10 mM HEPES חיץ (pH 7.4) ל 500 ng / mL siGL4 פתרון. הכן את סדרת הדילול (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ננוגרם/מ”ל) של פתרון siGL4 כדי ליצור עקומת כיול עבור דגימות טריטון (+) וטריטון (-). לדלל את ההשעיה LNP 100 פעמים עם 10 mM HEPES חוצץ (pH 7.4). ערבבו את הדברים הבאים עבור פתרון טריטון (+): 980 μL של 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 μL של 10% w / v TritonX-100, ו 1.25 μL של ריבוגרין עבור 10 בארות של מיקרופלאט 96-well. ערבבו את הדברים הבאים עבור פתרון טריטון (-) : 1000 μL של 10 mM HEPES (pH 7.4) ו 1.25 μL של ריבוגרין עבור 10 בארות של מיקרו-לוחית 96-well. Pipette 100 μL של סדרת הדילול של פתרון siGL4 ומתלי LNP מדוללים לתוך הבארות של מיקרופלט שחור 96-well.הערה: סדרת הדילול של פתרון siGL4 והשעיות LNP מדוללות חולקו לארבעה מיקרווולים לכל תנאי. פיפטה 100 μL של פתרון הזיהוי (TritonX-100 (+) או טריטון (-)) לתוך הבארות.הערה: פתרון האיתור (TritonX-100 (+)) חולק לשתי בארות לכל דגימה לכל תנאי, ופתרון TritonX-100 (-) חולק לשתי הבארות הנותרות לכל מצב מדגם. לדגור על המיקרו-לוחית במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות קורא מיקרופלט באורך גל של 475 ננומטר. חשב את יעילות אנקפסולציית siRNA מהמשוואה הבאה19. 9. תרבות תאים הכן מדיום צמיחה המכיל DMEM, מומת בחום 10% FBS, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ”ל סטרפטומיצין, ו 400 מיקרוגרם / מ”ל G418. תרבית HeLa תאים ביציבות ביטוי גחלילית ו Renilla לוציפראז (HeLa-dluc) בצלחת תרבית תאים 100 מ”מ TC מטופלת המכילה את מדיום הצמיחה ב 37 °C (5° C) בחממה 5% CO2 . 10. בדיקת הכדאיות של התא זרע 100 μL של השעיה של תאי HeLa במדיום הצמיחה (6 x 103 תאים / טוב) במיקרופלטה 96-well.הערה: תאים נספרו באמצעות לוח מונה תאים ומיקרוסקופ. לדגור על המיקרו-לוחית ל-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . לדלל את LNPs טעון siRNA עם DMEM (FBS (-)) בריכוזים של 10 ו 100 nM siRNAs. פטר 100 μL של השעיית LNP טעון siRNA מדולל לכל באר. לדגור על המיקרו-לוחית ל-4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . הסר את מתלי LNP והוסף 100 μL של DMEM (FBS (+)). לדגור על המיקרו-לוחית ל-20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . מדוד את הכדאיות של התא באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.הערה: D-PBS (-) שימש כפקד השלילי. 11. בדיקת נוקאאוט גן לוציפראז זרע 75 μL של השעיה של תאי HeLa במדיום הצמיחה (4.5 x 103 תאים / טוב) במיקרו-לוחית 96-well. לדגור על המיקרו-לוחית ל-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . לדלל את LNPs טעון siRNA עם DMEM (FBS (-)) בריכוזים של 10 ו 100 nM siRNAs. חלוק 75 μL של ההשעיה LNP טעון siRNA מדולל לכל באר אחת. לדגור על המיקרו-לוחית ל-4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . הסר את מתלי LNP והוסף 75 μL של DMEM (FBS (+)). לדגור על המיקרו-לוחית ל-20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 . מדוד את ביטוי הלוציפראז באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.הערה: השתמשנו ב- D-PBS (-) כפקד השלילי.