מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של צעדים כיצד להשתמש במערכת רב-תכליתית משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה רב-ערוצית אוטומטית וניתוח מכנוביולוגי כדי להבהיר את הרגישות המכנית של חלבון הקשור ל-Yes (YAP).
הדמיה וניתוח רב-תכליתי לטווח ארוך של תאים חיים דורשים תיאום פונקציונלי יעיל של פלטפורמות חומרה ותוכנה שונות. עם זאת, שליטה ידנית של ציוד שונים המיוצר על ידי יצרנים שונים היא עבודה אינטנסיבית וגוזלת זמן רב, פוטנציאל הפחתת הדיוק, רבייה, ואיכות של נתונים שנרכשו. לכן, מערכת All-in-One וניתן לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת רכישת תמונה אוטומטית, רב-תכליתית וארוכת טווח ותואמת לרוב פלטפורמות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטיות יכולה להועיל לקהילה המדעית. מאמר זה מציג את פרוטוקולי ההפעלה המלאים של שימוש במערכת תוכנה משולבת חדשנית המורכבת מ- (1) תוכנה ביתית, שכותרתה “תוכנית אינטגרציה רב-תכליתית אוטומטית (AMFIP),” המאפשרת רכישה אוטומטית של הדמיה רב-ערוצית, ו-(2) חבילה של ניתוח הדמיה כמותית וחבילות חישוב המתיחה התאית.
מערכת משולבת זו מיושמת כדי לחשוף את הקשר שלא היה ידוע קודם לכן בין ההתפלגות המרחבית-זמנית של חלבון רגיש למכנו (YAP) לבין מכניקת התאים, כולל התפשטות תאים ומתיחה, בתאים רגילים אנושיים מהונדסים CRISPR/Cas9 (B2B) ותאי סרטן ריאות (PC9). מינוף היכולת של מערכת זו של שליטה רב ערוצית וקריאה, התוצאה מראה: (1) תאים רגילים B2B ותאי סרטן PC9 להראות קשר מובהק בין ביטוי YAP, המתיחה, ודינמיקה תא במהלך תהליכי הפצת תאים והעברה; ו-(2) תאי סרטן PC9 מיישמים כוחות פרי-גרעיניים בולטים על מצעים. לסיכום, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט על אופן השימוש במערכת משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה וניתוח רב-תכליתיים אוטומטיים כדי להבהיר את רגישות המכנית של YAP. כלים אלה פותחים את האפשרות לחקר מפורט של דינמיקת איתות רבת פנים בהקשר של פיזיולוגיה ופתולוגיה של תאים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר הדמיה וניתוח רב-תכליתיים רב-תכליתיים אופטיים של תאים חיים. תוכנית הדמיה All-in-One המאפשרת תיאום אוטומטי של התקנים אופטואלקטרוניים רב-תכליתיים תפחית את הפעילות הידנית עתירת העבודה והנוטה לשגיאות והיא חיונית לחוקרים לביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים 1,2,3,4. עם זאת, רוב התוכניות הציבוריות הקיימות בקהילת המחקר הביו-רפואי חלות רק על התקנים אופטואלקטרוניים מוגבלים או דורשות חומרה נוספת לתיאום ציוד שונה 5,6,7,8,9. לאחרונה פותחה תוכנית מבוססת קוד פתוח ותוכנה בשם “תוכנית אינטגרציה רב-תכליתית אוטומטית (AMFIP),” המאפשרת הדמיה רב-ערוצית וזמן לשגות. מבוסס על שפת Java וממשק תכנות היישומים (API) של μManager11,12, AMFIP פותח כתוסף ב- μManager המבצע סקריפטים מותאמים אישית של Java כדי להשיג תקשורת מבוססת תוכנה של פלטפורמות חומרה ותוכנה אופטואלקטרוניות מרובות, כולל אך לא מוגבל לאלה של ניקון. הקמת AMFIP פותחת את האפשרות לחקירה ניתנת לתכנות ורב תפקודית של התנהגויות תאים. מערכת ניסיונית וחישובית משולבת מפותחת בעיתון זה ומשלבת AMFIP עם ניתוח הדמיה דיגיטלית ומיקרוסקופיה של כוח משיכת התא. המערכת מאפשרת את ההבהרה של המכנוביולוגיה הייחודית של YAP בקווים של תאי B2B רגילים אנושיים (איור 1) וסרטן ריאות מסוג CRISPR/Cas9 וסרטן ריאות PC9 (איור 2). המערכת מספקת לקהילה המדעית פתרון מקיף המונע את הדרישה לרכישת מכשירי בקרה נוספים שייתכן שאינם זמינים ו/או תואמים לכל מערכת הדמיה.
הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה מציגים כיצד (1) להחיל AMFIP כדי לבצע הדמיה אוטומטית לטווח ארוך עבור שני קווי תא מהונדסים CRISPR / Cas9 המבטאים את YAP המתויג mNEonGreen2; וכן (2) לשלב את פיג’י ImageJ, MATLAB ו-Origin לניתוח כמותי של יחס הגרעין/ציטופלסמה (N/C) של YAP בהתבסס על עוצמתם הפלואורסצנטית (איור 3 ואיור 4), שדה תזוזה תאית (איור 1C ואיור 2C) ושדה המתיחה התאית (איור 1D ואיור 2D ). התוצאות מצביעות על כך ש-(1) במהלך 10 השעות הראשונות של התפשטות התאים על המצעים בעלי קשיחות מכנית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית13,14,15,16,17,18, יחס YAP N/C של תאי B2B בודדים מראה וריאציה ותנודות תלויות זמן בולטות יותר בהשוואה לזו של תאי PC9 בודדים (איור 5 ואיור 6 ); ו-(2) תאי סרטן PC9 מייצרים אחיזה ניכרת באזורים הפרי-גרעיניים שלהם (איור 7). המערכת והמתודולוגיות המשולבות המתוארות בפרוטוקול זה מתעלה על סוגי התאים והמולקולות האופטוגנטיות הספציפיות. חוקרים יכולים ליישם את הפרוטוקולים כדי להתאים אישית את ניסויי החקירה הספציפיים שלהם בתא חי ולהבהיר דינמיקת איתות רבת פנים בהקשר של פיזיולוגיה של תאים ופתולוגיה.
תהליך ההדמיה (שלב 6.3) הוא קריטי כדי להבטיח שתמונות הפלואורסצנטיות יהיו באיכות טובה מספיק כדי להניב תוצאות כימות תקפות. תמונות z-stack של חלבון פלואורסצנטי או חרוזים צריך להיות z-טווח כי הוא גדול מספיק כדי לכלול את התמונות בפוקוס עבור כל Z-עמדות כי המדגם משתרע. צעד קריטי נוסף הוא איסוף תמונות הייחוס של חרוזים פלואורסצנטיים לאחר המסת התאים (שלב 6.5). מכיוון שיש לצלם את תמונות הייחוס באותן עמדות בשלב 6.3, אין לגרום לתזוזה יחסית בין צלחת הפטרי, תא הסביבה והמיקרוסקופ. החוקרים המבצעים את שלב ההתמוססות חייבים להיות זהירים כדי להסיר את המכסה של צלחת פטרי ולוודא כי ההפרעה המכנית מיושמת אינה גדולה מספיק כדי לשנות את המיקום של המנה בחדר הסביבה.
פתרונות מסופקים להלן כדי לפתור שגיאות מסוימות שעלולות להתרחש במהלך ניסויים. אם אף מאקרו אינו מופעל לאחר לחיצה על Enter בשלב 6.4, סביר להניח שהסיבה לכך היא שהאזור התחתון השמאלי של המסך תפוס על-ידי חלון שאינו רכיב. במקרה כזה, יש לנקות את האזור התחתון השמאלי של החלון כך שניתן יהיה להפעיל פקודות מאקרו ברכיבים. שגיאה נפוצה נוספת היא שתמונות השדה הבהיר נראות שחורות. בעיה זו נגרמת על ידי מרווח זמן לא מספיק בין הרכישות של תמונות פלואורסצנטיות ותמונות שדה בהיר. עיכובים קלים בספירת זמן הדמיית הפלואורסצנטיות יכולים להצטבר לאורך זמן ולגרום לעיכובים ניכרים ולהפריע להדמיית שדה בהיר. פתרון אחד הוא להתאים את משך מחזור הדמיה אחד של כל העמדות להיות קטן (לא שווה) מרווח הזמן בין תחילת תנועות רצופות. פעולה זו מרעננת את ספירת הזמן ומבטלת את השגיאה המצטברת בתחילת כל מחזור הדמיה.
טכנולוגיית חקירה כל-אופטית זו תומכת (1) במגוון רחב של חומרה/תוכנה, כולל ניקון, (2) סוגים שונים של מערכות הידרוג’ל מאומתות, כולל ג’לטין, PEG, מטריגל וקולגן I ג’לים, ו-(3) התאמה אישית הניתנת לתכנות המבוססת על צרכים שונים של חוקרים. עם זאת, אם אחת מפונקציות הבקרה ברמה התחתונה אינה זמינה ממיקרוסקופ מסחרי, התאמה אישית של הפונקציות באמצעות AMFIP הופכת למאתגרת. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא הסחף המרחבי של המדגם הן במישור XY והן במישורי המיקוד (Z). למרות מגבלה זו ניתן להתגבר במהלך לאחר עיבוד של התמונות, זה חיוני כדי לשפר את פונקציית המיקוד האוטומטי כדי לתקן את הסחף בזמן אמת של הדגימות. שיפור זה יגדיל את התפוקה של תהליך ההדמיה ולהפחית את השגיאה הפוטנציאלית הנגרמת על ידי הסחף במהלך ניסויים.
Mechanotransducers, כגון YAP, עשוי לשמש כיעדים טיפוליים חדשים לפיתוח טיפולים מבטיחים לסרטן25,26,27. נתונים חדשים מצביעים על כך ש-YAP מקדמת את התפשטותם ופלישה לתאים סרטניים. טרנסלוקציה YAP המושרה על ידי מכניקה מהציטופלסמה לגרעין מפעילה את שעתוק הגנים הקשורים להגירת תאים, התפשטות, פלישה ואפופטוזיס, מה שמוביל להתנהגויות תאים חריגות28,29,30,30,31. עבודה זו נועדה לחקור את המתאם הפוטנציאלי של יחס YAP N / C ומכניקת תאים בשני סרטן ריאות אנושי טיפוסי וקווי תאים נורמליים. במהלך תקופת התפשטות התאים של 10 שעות, תאי PC9 מראים ריכוזי YAP דומים בגרעין ובציטופלסמה (איור 3D ואיור 5A). תאי B2B מראים ריכוז YAP גבוה יותר בגרעין מאשר בציטופלסמה (איור 3C ואיור 5A). קשר זה שנמצא בשלב ההתפשטות המוקדמת שונה מרוב הממצאים שפורסמו המשווים ריכוז YAP בגרעין בין תאים נורמליים לסרטניים. אמנם לא בהכרח בשלב ההתפשטות המוקדמת, רוב הממצאים שפורסמו מראים כי YAP מרוכז יותר בגרעין של תאים סרטניים מאשר בגרעין של תאים נורמליים27,28. רק מחקר אחד על סרטן השד דיווח על חריג 32 שמראה YAP מרוכז יותר ציטופלסמה, אשר מסכים עם התצפיות הנוכחיות שלנו שנעשו בתאי PC9 סרטן ריאות. למיטב ידיעת המחברים, עבודה זו היא הראשונה להראות יחס נמוך יותר של YAP N/C בקו תאי סרטן ריאות אנושיים. המחברים משערים כי הסיבה ליחס יציב של YAP N/C בתאי PC9 עשויה לנבוע מהשינוי הנמוך באזור התפשטות התא/גרעין ומתיחה בתאי PC9 בשלב ההתפשטות המוקדם. הניתוח של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של יחס YAP N/C נמוך בתאי PC9 ו- B2B נמשך.
במהלך 10 השעות הראשונות של ההתפשטות, שני קווי תאים אלה מציגים קשר ברור בין יחס YAP N/C, המתיחה של התא ואזור ההתפשטות (איור 5). עבור תאי B2B, יחס YAP N/C גבוה יותר מתואם עם אזור התפשטות גבוה יותר של תאים וגרעין (איור 6A,B), התואם את הנתונים המדווחים של תאים נורמליים אחרים33. מעניין, למרות המגמה ההתפתחותית של קשר זה נמצא בדרך כלל בכל תאי B2B שנרשמו, שתי מעלות שונות (גבוה ונמוך) של קשר זה נמצאים. תאי B2B המתפשטים ומעבירים בו-זמנית מראים אחיזה נמוכה יותר ואזור התפשטות גבוה יותר של תאים וגרעין עם יחס YAP N/C גבוה יותר (2.05 ± 0.32). עבור תאי B2B המתפשטים ונשארים באותו מיקום, הם מראים אחיזה גבוהה יותר ואזור התפשטות תאים וגרעין תחתון עם יחס YAP N/C נמוך יותר (1.74 ± 0.21). שתי דרגות אלה של קשרי גומלין מודגמות בקבוצות הנתונים הפזורות (איור 6C, D). כפי שדווח בספרות, תאים רגילים נייחים, כגון תאי פיברובלסט עוברי NIH 3T3, יש המתיחה גבוהה יותר מאשר תאים נודדים34. הנתונים שדווחו במאמר זה מצביעים על כך שתאי B2B המתפשטים והלא נודדים הפעילו מתיחות גבוהות יותר מאשר הפצה והעברה של תאי B2B, מה שמצביע ככל הנראה על כך שנדרשת משיכה גבוהה כדי שתאים שאינם נודדים יתייצבו על המצע.
בנוסף, נתונים אלה מראים כי תאי B2B רגילים נייחים מייצרים כוח פרי-גרעיני גבוה יותר, ואילו מחקרים קודמים שנערכו על ידי חוקרים אחרים דיווחו רק על אחיזת תאים גבוהה יותר שנוצרה בשוליים של תאים נייחים34,35,36,37. המחברים סבורים כי ההבדל בנטייה המהותית של הגירה בניסויים עלול לגרום לתוצאות סותרות אלה. בניסויים שפורסמו, micropatterning בצורת ריבוע שימש כדי להגביל תאים בודדים מלהתפשט ולעכב הגירה; לא ידוע אם לתאים הייתה נטייה לנדוד. מכיוון שתאים נודדים מראים לעתים קרובות כוח משיכה גבוה בשולי התאים38, סביר להניח שתאים בעלי נטייה לנדוד עדיין ישמרו על אחיזה גבוהה בפריפריה למרות שהנדידה שלהם מוגבלת. במחקר הנוכחי, התאים הנייחים אינם מוגבלים על ידי כל micropattern אבל לא נודדים, המציין כי התאים נוטים לשמור על מצבם שאינו נודד. אפשרות נוספת היא שצורת התא המוגדרת על ידי המיקרו-פאטרן עשויה להשפיע על התפלגות הידבקויות המוקד וכוחות המתיחה39. התוצאות במחקר זה נוצרו ללא כל micropatterning confining ומייצגים את התפלגות הכוח של תאים נייחים בצורתם המקורית.
למיטב ידיעת המחברים, רק פרסום אחד עד כה דיווח באופן ספציפי על מציאת כוחות פרי-גרעיניים בתאים רגילים (פיברובלסטים עובריים של עכבר), שעלולים להיגרם על ידי כובע האקטין המשתרע על פני הגרעין40. טרנסלוקציה של ציטופלסמה לגרעין YAP מתואמת עם הגידול בכוח הפרי-גרעיני40. חיפוש מעמיק בספרות הרלוונטית לא הניב פרסומים המדווחים על כוח פרי-גרעיני או על מכסה אקטין בתאים סרטניים. מחקר עקיף על תאי סרטן מלנומה הראה כי שפת האקטין (ארגון אחר של אקטין פרי-גרעיני הממוקם סביב אך לא מכסה את הגרעין) מפחית את שיעורי נדידת התאים41, מה שמרמז בעקיפין על קיומו של כוח פרי-גרעיני. עם זאת, לא מדווחים נתונים ניסיוניים ישירים. במחקר זה, המחברים מצאו כי הן PC9 והן B2B תאים להראות עקירה פרי גרעיני ומתיחה. המנגנונים של דור הכוחות הפרי-גרעיניים והשפעותיהם נותרו שנויים במחלוקת. בתאים רגילים, כובע actin דווח לשחק תפקיד בוויסות גרעין מורפולוגיה וארגון כרומטין42, העברת אותות מכניים מהידבקויות מוקד לתוך הגרעין באמצעות קישורים של נוקלאוסקלטון ו cytoskeleton (LINC) complex43, ויסות נדידת תאים44. Lamin מיזוג אוויר קשור להיווצרות ושיבוש של cap actin cap40,41,42,43,44. עם זאת, הדו”ח שטען כי מכסה actin מייצר כוח פרי גרעיני לא לקח בחשבון את התפקיד הפוטנציאלי של rim40 actin. בתאים סרטניים, ביטוי יתר של Lamin A מקל על היווצרות שפת אקטין ומגביל את נדידת התא הסרטני. ביטוי יתר של לאמין B מפחית את היווצרות שפת האקטין ומקדם הגירה. הכוח הפרי-גרעיני עשוי להיות מעורב בתהליך זה בשל קיומו של ארגון פרי-גרעיני אקטין ואת ההשפעה של Lamin A. עם זאת, תוצאות מחקר זה לא הראו כל עדות לכוחות פרי-גרעיניים מדודים או להתנהגות של כובע actin. לכן, גילוי כוחות פרי-גרעיניים בתאי PC9 במחקר הנוכחי הוא הדו”ח הראשון המציג כוחות פרי-גרעיניים ועקירות בתאי סרטן ריאות. המחברים חוקרים כעת את המנגנונים המולקולריים והפונקציות של כוחות פרי-גרעיניים בתאי PC9 ו- B2B מהונדסים CRISPR/ Cas9.
מעבר לחקירת המכנוביולוגיה הכל-אופטית המודגמת במאמר זה, ניתן ליישם את המערכת הרב-תכליתית המשולבת כדי לחקור אופטית מספר עצום של אותות פיזיולוגיים ופתוביולוגיים חיוניים אחרים במערכות חיות. לדוגמה, המעבדה של המחברים הקימה לאחרונה מספר רב של קווי תאים סרטניים אנושיים שעברו ביציבות, המבטאים במשותף שלושה חלבוני קרום מגיבים לאור: מחוון מתח הממברנה QuasAr2 (עירור: 640 ננומטר; פליטה: 660 nm-740 ננומטר), depolarizer מתח הממברנה CheRiff (עירור: 488 ננומטר), ומתח ממברנה hyperpolarizer eNpHR3 (עירור: 590 ננומטר). שלושת החלבונים הפונקציונליים האלה יכולים להיות מופעלים על ידי קווי לייזר ספקטרום אורתוגונליים באופן נטול מגעים צולבים, ומאפשרים תקשורת איתות דו-כיוונית כל-אופטית (קריאה ובקרה) של אלקטרופיזיולוגיה של הממברנה. באמצעות מערכת אופטו-אלקטרוניקה משולבת ומהדק תיקון ידני, המחברים אימתו את השליטה והכל אופטית ואת הקריאה של מתח הממברנה (Vm) בתאי סרטן אנושיים בודדים וספרואידים גידול רב תאיים. חקירת האלקטרופיזיולוגיה האופטית פותחת את האפשרות לחקירה מפורטת של ביואלקטריות בלתי נגישה בעבר בתאים סרטניים, אשר עשויה לסייע בקידום הביולוגיה של הגידול מציר חדש.
The authors have nothing to disclose.
פרויקט זה נתמך כלכלית על ידי פרס פיילוט הסרטן מטעם המרכז לסרטן בריאות UF (X. T. ו- D. S. ) וחבילת הסטארט-אפ פרס Gatorade (X. T.). המחברים מעריכים בכנות את הדיונים האינטלקטואליים עם ואת התמיכה הטכנית של ד”ר ג’ונתן ליכט (UFHCC), ד”ר רולף רן (UFHCC), ד”ר ג’י-היון לי (ביוסטטיסטיקה, UF), ד”ר יו פאן (MAE, UF), ד”ר וורן דיקסון (MAE, UF), ד”ר Ghatu Subhash (MAE, UF), ד”ר מארק Sheplak (MAE & ECE, UF), ד”ר מליסה Sarntinoranont (MAE, UF), ד”ר סקוט בנקס (MAE, UF), ד”ר סקוט בנקס (MAE, UF, UF), ד”ר מתיו טראום (MAE, UF), ד”ר דיוויד האן (אוניברסיטת אריזונה), ד”ר וויהונג וואנג (תאגיד אורקל), ד”ר יוחואה טאן (האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג) וצוות התמיכה של ניקון (ד”ר חוזה סראנו-ולז, לארי קורדון וג’ון אקמן). המחברים אסירי תודה על התמיכה הנדיבה והיעילה של כל חברי מעבדות המחקר של טאנג, סימנס וגואן וכל אנשי הצוות של MAE & ECE & המחלקות האונקולוגיות לפיזיקה וקרינה, UF.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |