Cet article présente un protocole détaillé par étapes sur la façon d’utiliser un système intégré multifonctionnel et programmable par l’utilisateur qui permet l’imagerie multicanal automatique et l’analyse mécanobiologique pour élucider la mécanosensibilité de la protéine associée au Oui (YAP).
L’imagerie et l’analyse multifonctionnelles à long terme des cellules vivantes nécessitent une coordination fonctionnelle rationalisée de diverses plates-formes matérielles et logicielles. Cependant, le contrôle manuel de divers équipements produits par différents fabricants est laborieux et prend beaucoup de temps, ce qui peut réduire la précision, la reproductibilité et la qualité des données acquises. Par conséquent, un système tout-en-un et programmable par l’utilisateur qui permet l’acquisition d’images automatique, multifonctionnelle et à long terme et qui est compatible avec la plupart des plates-formes de microscopie fluorescente peut bénéficier à la communauté scientifique. Cet article présente les protocoles d’exploitation complets de l’utilisation d’un nouveau système logiciel intégré qui se compose de (1) un logiciel construit à la maison, intitulé « Programme d’intégration multifonctionnelle automatique (AMFIP) », qui permet l’acquisition automatique d’imagerie multicanal, et (2) une suite de packages d’analyse d’imagerie quantitative et de calcul de traction cellulaire.
Ce système intégré est appliqué pour révéler la relation auparavant inconnue entre la distribution spatio-temporelle de la protéine associée au Oui mécano-sensible (YAP) et la mécanique cellulaire, y compris l’étalement et la traction cellulaires, dans les cellules normales humaines (B2B) et les cellules cancéreuses du poumon (PC9) modifiées par CRISPR / Cas9. Tirant parti de la capacité de contrôle et de lecture multicanal de ce système, le résultat montre : (1) les cellules normales B2B et les cellules cancéreuses PC9 montrent une relation distincte entre l’expression YAP, la traction et la dynamique cellulaire pendant les processus de propagation et de migration cellulaires ; et (2) les cellules cancéreuses PC9 appliquent des forces périnucléaires notables sur les substrats. En résumé, cet article présente un protocole détaillé par étapes sur la façon d’utiliser un système intégré programmable par l’utilisateur qui permet l’imagerie et l’analyse multifonctionnelles automatiques pour élucider la mécanose YAP. Ces outils ouvrent la possibilité d’explorations détaillées de la dynamique de signalisation multiforme dans le contexte de la physiologie et de la pathologie cellulaires.
L’objectif global de cette méthode est de permettre l’imagerie multifonctionnelle entièrement optique et l’analyse des cellules vivantes. Un programme d’imagerie tout-en-un qui permet la coordination automatique de dispositifs optoélectroniques multifonctionnels réduira les opérations manuelles à forte intensité de main-d’œuvre et sujettes aux erreurs et est essentiel pour que les chercheurs puissent effectuer une imagerie à long terme sur cellules vivantes1,2,3,4. Cependant, la plupart des programmes publics existants dans le milieu de la recherche biomédicale ne s’appliquent qu’à des dispositifs optoélectroniques limités ou nécessitent du matériel supplémentaire pour la coordination de différents équipements5,6,7,8,9. Récemment, un programme open source et logiciel a été développé, intitulé « Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP) », permettant l’imagerie multicanal et time-lapse. Basé sur le langage Java et l’interface de programmation d’application (API) de μManager11,12, AMFIP a été développé en tant que plugin dans μManager qui exécute des scripts Java personnalisés pour effectuer des communications logicielles de plusieurs plates-formes matérielles et logicielles optoélectroniques, y compris, mais sans s’y limiter, celles de Nikon. La mise en place de l’AMFIP ouvre la possibilité d’une interrogation programmable et multifonctionnelle des comportements cellulaires. Un système expérimental et informatique intégré est développé dans cet article et combine AMFIP avec l’analyse d’imagerie numérique et la microscopie à force de traction cellulaire. Le système permet d’élucider la mécanobiologie YAP distincte dans les lignées cellulaires B2B humaines normales (Figure 1) et PC9 du cancer du poumon (Figure 2) conçues par CRISPR/Cas9. Le système fournit à la communauté scientifique une solution complète qui évite la demande d’achat de dispositifs de contrôle supplémentaires qui peuvent ne pas être disponibles et / ou compatibles avec tous les systèmes d’imagerie.
Les protocoles présentés dans cet article présentent comment (1) appliquer l’AMFIP pour effectuer une imagerie automatique à long terme pour les lignées cellulaires crispr / Cas9 qui expriment le YAP marqué mNEonGreen2; et (2) combiner Fiji ImageJ, MATLAB et Origin pour l’analyse quantitative du rapport nucléaire/cytoplasme (N/C) YAP en fonction de leur intensité fluorescente (Figure 3 et Figure 4), du champ de déplacement cellulaire (Figure 1C et Figure 2C) et du champ de traction cellulaire (Figure 1D et Figure 2D) ). Les résultats suggèrent que (1) au cours des 10 premières heures d’étalement cellulaire sur les substrats qui ont une rigidité mécanique physiologiquement pertinente13,14,15,16,17,18, le rapport N/C YAP des cellules B2B simples montre une variation et une fluctuation plus notables en fonction du temps par rapport à celles des cellules PC9 individuelles (Figure 5 et Figure 6 ); et (2) les cellules cancéreuses PC9 génèrent une traction notable dans leurs régions périnucléaires (figure 7). Le système intégré et les méthodologies décrites dans ce protocole transcendent les types spécifiques de cellules et de molécules optogénétiques. Les chercheurs peuvent appliquer les protocoles pour personnaliser leurs expériences spécifiques d’interrogation de cellules vivantes et élucider la dynamique de signalisation multiforme dans le contexte de la physiologie et de la pathologie cellulaires.
Le processus d’imagerie (étape 6.3) est essentiel pour s’assurer que les images de fluorescence sont de qualité suffisante pour donner des résultats de quantification valides. Les images z-stack de protéines fluorescentes ou de perles doivent avoir une plage z suffisamment grande pour inclure les images focalisées pour toutes les positions Z que l’échantillon couvre. Une autre étape critique consiste à collecter les images de référence des billes fluorescentes après dissolution des cellules (étape 6.5). Étant donné que les images de référence doivent être prises aux mêmes positions à l’étape 6.3, aucun déplacement relatif ne doit être induit entre la boîte de Pétri, la chambre d’environnement et le microscope. Les enquêteurs effectuant l’étape de dissolution doivent veiller à retirer le couvercle de la boîte de Pétri et à s’assurer que la perturbation mécanique appliquée n’est pas assez importante pour modifier l’emplacement de la boîte dans la chambre de l’environnement.
Des solutions sont fournies ci-dessous pour résoudre certaines erreurs qui peuvent se produire pendant les expériences. Si aucune macro n’est activée après avoir cliqué sur Entrée à l’étape 6.4, c’est probablement parce que la zone inférieure gauche de l’écran est occupée par une fenêtre non-Élément. Dans ce cas, la zone inférieure gauche de la fenêtre doit être effacée afin que les macros puissent être activées dans Elements. Une autre erreur courante est que les images en champ lumineux apparaissent en noir. Ce problème est dû à un intervalle de temps insuffisant entre les acquisitions d’images de fluorescence et d’images en champ lumineux. De légers retards dans le comptage du temps d’imagerie par fluorescence peuvent s’accumuler au fil du temps et causer des retards considérables et interférer avec l’imagerie en champ lumineux. Une solution consiste à ajuster la durée d’un cycle d’imagerie de toutes les positions pour qu’elle soit inférieure (non égale à) l’intervalle de temps entre le début des mouvements consécutifs. Cette opération actualise le comptage du temps et élimine l’erreur cumulative au début de chaque cycle d’imagerie.
Cette technologie d’interrogation entièrement optique prend en charge (1) une large gamme de matériel / logiciels, y compris, mais sans s’y limiter, Nikon, (2) divers types de systèmes d’hydrogel validés, y compris les gels de gélatine, peg, Matrigel et collagène I, et (3) la personnalisation programmable en fonction des différents besoins des chercheurs. Cependant, si l’une des fonctions de contrôle de niveau inférieur n’est pas disponible à partir d’un microscope commercial, la personnalisation des fonctions à l’aide d’AMFIP devient difficile. Une autre limitation de cette technique est la dérive spatiale de l’échantillon dans les plans XY et focal (Z). Bien que cette limitation puisse être surmontée lors du post-traitement des images, il est essentiel d’améliorer la fonction de mise au point automatique pour corriger la dérive en temps réel des échantillons. Cette amélioration augmentera le débit du processus d’imagerie et réduira l’erreur potentielle causée par la dérive pendant les expériences.
Les mécanotransducteurs, tels que le YAP, pourraient servir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de thérapies prometteuses contre le cancer25,26,27. Les données émergentes suggèrent que le YAP favorise la prolifération et l’invasion des cellules cancéreuses. La translocation YAP induite par la mécanique du cytoplasme au noyau active la transcription des gènes liés à la migration cellulaire, à la prolifération, à l’invasion et à l’apoptose, conduisant à des comportements cellulaires aberrants28,29,30,31. Ce travail visait à explorer la corrélation potentielle du rapport N/C YAP et de la mécanique cellulaire dans deux cancers du poumon humains typiques et des lignées cellulaires normales. Au cours de la période d’étalement cellulaire de 10 h, les cellules PC9 présentent des concentrations de YAP similaires dans le noyau et le cytoplasme (figure 3D et figure 5A). Les cellules B2B présentent une concentration de YAP plus élevée dans le noyau que dans le cytoplasme (Figure 3C et Figure 5A). Cette relation observée au stade précoce de la propagation est différente de la majorité des résultats publiés qui comparent la concentration de YAP dans le noyau entre les cellules normales et cancéreuses. Bien que pas nécessairement au stade précoce de la propagation, la plupart des résultats publiés montrent que le YAP est plus concentré dans le noyau des cellules cancéreuses que dans le noyau des cellules normales27,28. Une seule étude sur le cancer du sein a rapporté une exception32 qui montre que le YAP est plus concentré dans le cytoplasme, ce qui concorde avec nos observations actuelles faites dans les cellules PC9 du cancer du poumon. À la connaissance des auteurs, ce travail est le premier à montrer un rapport N/C YAP plus faible dans une lignée cellulaire de cancer du poumon humain. Les auteurs émettent l’hypothèse que la raison d’un rapport N/C YAP stable dans les cellules PC9 pourrait être due à la faible variation de la zone de propagation cellule/noyau et à la traction dans les cellules PC9 au stade précoce de la propagation. La dissection des mécanismes moléculaires sous-jacents du faible rapport N/C YAP dans les cellules PC9 et B2B est en cours.
Au cours des 10 premières heures d’étalement, ces deux lignées cellulaires montrent une relation distincte entre le rapport N/C YAP, la traction cellulaire et la zone d’étalement (figure 5). Pour les cellules B2B, un rapport N/C YAP plus élevé est corrélé à une zone de propagation plus élevée des cellules et du noyau (Figure 6A,B), ce qui est cohérent avec les données rapportées d’autres cellules normales33. Fait intéressant, bien que la tendance de développement de cette relation se retrouve généralement dans toutes les cellules B2B enregistrées, deux degrés différents (élevés et faibles) de cette relation sont trouvés. Les cellules B2B qui se propagent et migrent simultanément présentent une traction plus faible et une zone de propagation cellulaire et noyau plus élevée avec un rapport N/C YAP plus élevé (2,05 ± 0,32). Pour les cellules B2B qui se propagent et restent au même endroit, elles présentent une traction plus élevée et une zone de propagation plus faible des cellules et du noyau avec un rapport N/C YAP plus faible (1,74 ± 0,21). Ces deux degrés de relations sont démontrés dans les groupes de données dispersés bifurqués (Figure 6C,D). Comme indiqué dans la littérature, les cellules normales stationnaires, telles que les cellules embryonnaires de fibroblastes NIH 3T3, ont une traction plus élevée que les cellules migratrices34. Les données rapportées dans cet article suggèrent que les cellules B2B étalées et non migratrices ont appliqué une traction plus élevée que les cellules B2B étalées et en migration, ce qui suggère probablement qu’une traction élevée est nécessaire pour que les cellules non migratrices se stabilisent sur le substrat.
En outre, ces données montrent que les cellules B2B normales stationnaires génèrent une force périnucléaire plus élevée, alors que des recherches antérieures menées par d’autres chercheurs n’ont rapporté qu’une traction cellulaire plus élevée générée à la périphérie des cellules stationnaires34,35,36,37. Les auteurs pensent que la différence dans la tendance intrinsèque de la migration dans les expériences pourrait être à l’origine de ces résultats contradictoires. Dans les expériences publiées, des micromotifs de forme carrée avaient été utilisés pour confiner des cellules individuelles de la propagation et inhiber la migration; on ne sait pas si les cellules avaient tendance à migrer. Comme les cellules migratrices présentent souvent une force de traction élevée à la périphérie des cellules38, il est probable que les cellules ayant tendance à migrer conserveront toujours une traction périphérique élevée même si leur migration est limitée. Dans la présente étude, les cellules stationnaires ne sont limitées par aucun micromotif mais ne migrent pas, ce qui indique que les cellules ont tendance à maintenir leur état de non-migration. Une autre possibilité est que la forme de la cellule définie par le micromotif puisse affecter la distribution des adhérences focales et des forces de traction39. Les résultats de cette étude ont été générés sans aucun micromotif confinant et représentent la distribution de force des cellules stationnaires dans leur forme d’origine.
À la connaissance des auteurs, une seule publication à ce jour a spécifiquement rapporté la découverte de forces périnucléaires dans des cellules normales (fibroblastes embryonnaires de souris), potentiellement causées par le capuchon d’actine couvrant le noyau40. La translocation du cytoplasme au noyau YAP est corrélée à l’augmentation de la force périnucléaire40. Une recherche approfondie de la littérature pertinente n’a pas donné de publications qui rapportent une force périnucléaire ou le capuchon d’actine dans les cellules cancéreuses. Une étude indirecte sur les cellules cancéreuses du mélanome a démontré que le bord de l’actine (une autre organisation d’actine périnucléaire située autour du noyau mais ne le recouvrant pas) réduit les taux de migration cellulaire41, suggérant indirectement l’existence d’une force périnucléaire. Cependant, aucune donnée expérimentale directe n’est rapportée. Dans cette étude, les auteurs ont constaté que les cellules PC9 et B2B présentent un déplacement et une traction périnucléaires. Les mécanismes de génération des forces périnucléaires et leurs effets restent controversés. Dans les cellules normales, le capuchon d’actine a joué un rôle dans la régulation de la morphologie du noyau et de l’organisation de la chromatine42, la transmission des signaux mécaniques des adhérences focales dans le noyau par l’intermédiaire de liants du complexe nucléosquelette et cytosquelette (LINC)43, et la régulation de la migration cellulaire44. Lamin A / C est lié à la formation et à la perturbation du capuchon d’actine40,41,42,43,44. Cependant, le rapport qui affirmait que le bouchon d’actine génère une force périnucléaire ne tenait pas compte du rôle potentiel du bord d’actine40. Dans les cellules cancéreuses, la surexpression de Lamin A facilite la formation d’un bord d’actine et restreint la migration des cellules cancéreuses. La surexpression de Lamin B réduit la formation de bord d’actine et favorise la migration. La force périnucléaire pourrait être impliquée dans ce processus en raison de l’existence d’une organisation de l’actine périnucléaire et de l’effet de Lamin A. Cependant, les résultats de cette étude n’ont montré aucune preuve de forces périnucléaires mesurées ou du comportement du capuchon d’actine. Par conséquent, la découverte de forces périnucléaires dans les cellules PC9 dans cette étude est le premier rapport montrant les forces périnucléaires et les déplacements dans les cellules cancéreuses du poumon. Les auteurs étudient actuellement les mécanismes moléculaires et les fonctions des forces périnucléaires dans les cellules PC9 et B2B conçues par CRISPR / Cas9.
Au-delà de l’interrogation mécanobiologique entièrement optique démontrée dans cet article, le système multifonctionnel intégré peut être appliqué pour sonder optiquement une myriade d’autres signaux physiologiques et pathobiologiques essentiels dans les systèmes vivants. Par exemple, le laboratoire des auteurs a récemment établi plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines transductées de manière stable qui co-expriment trois protéines membranaires sensibles à la lumière: l’indicateur de tension membranaire QuasAr2 (excitation: 640 nm; émission: 660 nm-740 nm), le dépolariseur de tension membranaire CheRiff (excitation: 488 nm) et l’hyperpolarisateur de tension membranaire eNpHR3 (excitation: 590 nm). Ces trois protéines fonctionnelles peuvent être activées par des lignes laser orthogonales à spectre sans diaphonie, permettant des communications de signalisation bidirectionnelles entièrement optiques (lecture et contrôle) de l’électrophysiologie membranaire. À l’aide d’un système opto-électronique intégré et d’une pince à patch manuelle, les auteurs ont validé le contrôle et la lecture entièrement optiques de la tension membranaire (Vm) dans des cellules cancéreuses humaines uniques et des sphéroïdes tumoraux multicellulaires. L’interrogation électrophysiologique entièrement optique ouvre la possibilité d’explorations détaillées de la bioélectricité auparavant inaccessible dans les cellules cancéreuses, ce qui peut aider à faire progresser la biologie tumorale à partir d’un nouvel axe.
The authors have nothing to disclose.
Ce projet est soutenu financièrement par le Cancer Pilot Award de l’UF Health Cancer Center (X. T. et D. S.) et le Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Les auteurs apprécient sincèrement les discussions intellectuelles avec et le soutien technique du Dr Jonathan Licht (UFHCC), du Dr Rolf Renne (UFHCC), du Dr Ji-Hyun Lee (Biostatistique, UF), du Dr Hugh Fan (MAE, UF), du Dr Warren Dixon (MAE, UF), du Dr Ghatu Subhash (MAE, UF), du Dr Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), du Dr Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), du Dr Scott Banks (MAE, UF), Dr Matthew Traum (MAE, UF), Dr David Hahn (Université de l’Arizona), Dr Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr Youhua Tan (Université polytechnique de Hong Kong) et l’équipe de soutien de Nikon (Drs Jose Serrano-Velez, Larry Kordon et Jon Ekman). Les auteurs sont profondément reconnaissants pour le soutien généreux et efficace de tous les membres des laboratoires de recherche de Tang, Siemann et Guan et de tous les membres du personnel des départements MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology, UF.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |