本稿では、自動マルチチャンネルイメージングとメカノバイオロジカル解析を可能にし、Yes関連タンパク質(YAP)のメカノ感度を解明する統合多機能・ユーザープログラマブルシステムの活用方法に関する詳細な段階的プロトコルを提示する。
生細胞の長期的な多機能イメージングおよび解析には、さまざまなハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームの合理化された機能調整が必要です。しかし、異なるメーカーによって製造されたさまざまな機器を手動で制御することは、労働集約的で時間がかかり、取得したデータの精度、再現性、品質を低下させる可能性があります。したがって、自動、多機能、および長期の画像取得を可能にし、ほとんどの蛍光顕微鏡プラットフォームと互換性のあるオールインワンでユーザープログラマブルなシステムは、科学界に利益をもたらすことができます。本稿では、(1)マルチチャンネルイメージングの自動取得を可能にする「AMFIP(自動多機能統合プログラム)」と題した自家製ソフトウェアプログラムと、(2)定量イメージング解析と細胞牽引計算パッケージ群からなる、新しい統合ソフトウェアシステムを利用するための完全な動作プロトコルを紹介する。
この統合システムを適用して、CRISPR/Cas9で操作されたヒト正常細胞(B2B)および肺癌細胞(PC9)における、メカノ感受性Yes関連タンパク質(YAP)の空間時間分布と細胞拡散および牽引を含む細胞力学との間のこれまで知られていなかった関係を明らかにする。このシステムのマルチチャンネル制御と読み出しの機能を活用すると、結果は、(1)B2B正常細胞とPC9がん細胞は、細胞の拡散および遊走プロセス中のYAP発現、牽引、および細胞ダイナミクスの間に明確な関係を示す。(2)PC9癌細胞は、基質上に顕著な核周囲力を加える。要約すると、本稿では、YAPメカノ感度を解明するために、自動多機能イメージングおよび解析を可能にする統合ユーザプログラマブルシステムを利用する方法について、詳細な段階的プロトコルを提示する。これらのツールは、細胞生理学および病理学の文脈における多面的なシグナル伝達ダイナミクスの詳細な探査の可能性を開く。
この方法の全体的な目標は、生細胞の全光学多機能イメージングおよび解析を可能にすることです。多機能光電子デバイスの自動調整を可能にするオールインワンイメージングプログラムは、労働集約的でエラーが発生しやすい手動操作を削減し、研究者が長期間の生細胞イメージングを行うために不可欠です1,2,3,4。しかし、生物医学研究コミュニティにおける既存の公共プログラムのほとんどは、限られた光電子デバイスにのみ適用されるか、異なる機器の調整のために追加のハードウェアを必要とする5,6,7,8,9。最近では、「自動多機能統合プログラム(AMFIP)」と題したオープンソースのソフトウェアベースのプログラムが開発され、マルチチャンネルおよびタイムラプスイメージングが可能になりました。AMFIPは、Java言語とμManager11,12のアプリケーションプログラミングインタフェース(API)に基づいて、カスタマイズされたJavaスクリプトを実行して、ニコンのものを含むがこれに限定されない複数の光電子ハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームのソフトウェアベースの通信を実現するμManagerのプラグインとして開発されました。AMFIPの確立は、細胞挙動のプログラム可能で多機能な尋問の可能性を開きます。本稿では、AMFIPとデジタルイメージング解析および細胞牽引力顕微鏡を組み合わせた、統合された実験および計算システムを開発する。このシステムは、CRISPR/Cas9で操作されたヒト正常B2B(図1)および肺癌PC9(図2)細胞株における明確なYAP機構学の解明を可能にする。このシステムは、科学界に、すべてのイメージングシステムで利用できない、および/または互換性がない可能性のある追加の制御装置を購入する需要を回避する包括的なソリューションを提供します。
本稿で紹介するプロトコルでは、(1)AMFIPを適用して、mNEonGreen2タグ付きYAPを発現するCRISPR/Cas9遺伝子組み換え細胞株の両方に対して自動長期イメージングを行う方法を紹介します。(2)フィジーImageJ、MATLAB、およびOriginを組み合わせて、蛍光強度(図3および図4)、細胞変位場(図1Cおよび図2C)、および細胞牽引場(図1Dおよび 図2D)に基づくYAP核/細胞質(N / C)比の定量分析を行う。).この結果は、(1)生理学的に関連する機械的剛性を有する基板上で細胞が広がる最初の10時間の間に13,14,15,16,17,18、単一のB2B細胞のYAP N/C比が、単一のPC9細胞のそれと比較してより顕著な時間依存的な変動および変動を示すことを示唆している(図5および図6);(2)PC9がん細胞は、その核周囲領域において顕著な牽引力を生成する(図7)。このプロトコルに記載されている統合システムと方法論は、特定のタイプの細胞および光遺伝学的分子を超越しています。研究者は、このプロトコルを適用して、特定の生細胞尋問実験をカスタマイズし、細胞生理学および病理学の文脈における多面的なシグナル伝達ダイナミクスを解明することができる。
イメージングプロセス(ステップ6.3)は、蛍光画像が有効な定量結果を得るために十分に良質であることを保証するために重要です。蛍光タンパク質またはビーズの Z スタック画像は、サンプルがまたがるすべての Z 位置の焦点内画像を含めるのに十分な大きさの z 範囲を持つ必要があります。もう1つの重要なステップは、細胞を溶解した後の蛍光ビーズの基準画像を収集することである(ステップ6.5)。ステップ6.3で参照画像を同じ位置で撮影する必要があるため、シャーレ、環境チャンバ、顕微鏡間で相対的な変位を誘発しないでください。溶解ステップを実行する研究者は、ペトリ皿の蓋を取り外し、適用される機械的摂動が環境チャンバ内の皿の位置を変更するのに十分な大きさではないことを確認するように注意しなければならない。
実験中に発生する可能性のあるいくつかのエラーを解決するための解決策を以下に示します。手順 6.4 で Enter をクリックしてもマクロがアクティブにならない場合は、画面の左下の領域が [要素] 以外のウィンドウによって占有されている可能性があります。このような場合は、ウィンドウの左下の領域をクリアして、 Elementsでマクロをアクティブにする必要があります。もう1つの一般的なエラーは、明視野画像が黒く表示されることです。この問題は、蛍光画像と明視野画像の取得間の時間間隔が不十分であることが原因です。蛍光画像化の時間カウントにおけるわずかな遅延は、時間の経過とともに蓄積し、かなりの遅延を引き起こし、明視野画像化を妨害し得る。1つの解決策は、すべての位置の1つの撮像サイクルの持続時間を、連続した運動の開始間の時間間隔よりも短く(等しくない)ように調整することである。この操作により、時間カウントが更新され、各イメージングサイクルの開始時の累積誤差が排除されます。
この全光学的尋問技術は、(1)ニコンを含むがこれに限定されない幅広いハードウェア/ソフトウェア、(2)ゼラチン、PEG、マトリゲル、コラーゲンIゲルを含む多様なタイプの検証済みヒドロゲルシステム、および(3)研究者のさまざまなニーズに基づいてプログラム可能なカスタマイズをサポートします。しかし、市販の顕微鏡で最下位レベルの制御機能が利用できない場合、AMFIPを使用した機能のカスタマイズが困難になります。この手法のもう 1 つの制限は、XY 平面とフォーカス (Z) 平面の両方でのサンプルの空間ドリフトです。この制限は画像の後処理中に克服できますが、サンプルのリアルタイムドリフトを補正するためにオートフォーカス機能を改善することが不可欠です。この改善により、イメージングプロセスのスループットが向上し、実験中のドリフトによって引き起こされる潜在的な誤差が減少します。
YAPなどのメカノトランスデューサは、有望ながん治療法の開発のための新しい治療標的として役立つ可能性があります25,26,27。新たなデータは、YAPが癌細胞の増殖および浸潤を促進することを示唆している。力学によって誘導された細胞質から核へのYAP転座は、細胞遊走、増殖、浸潤、およびアポトーシスに関連する遺伝子の転写を活性化し、異常な細胞挙動をもたらす28、29、30、31。この研究は、2つの典型的なヒト肺癌と正常細胞株におけるYAP N/C比と細胞力学の潜在的な相関関係を探ることを目的としていた。10時間の細胞拡散期間中、PC9細胞は核および細胞質において同様のYAP濃度を示す(図3Dおよび図5A)。B2B細胞は、細胞質内よりも核内でより高いYAP濃度を示す(図3Cおよび図5A)。初期の拡散段階で発見されたこの関係は、正常細胞と癌細胞の間で核内のYAP濃度を比較する公表された知見の大部分とは異なる。必ずしも初期の拡散段階にあるわけではないが、ほとんどの公表された知見は、YAPが正常細胞の核よりも癌細胞の核に集中していることを示している27,28。乳がんに関する1つの研究のみが、YAPが細胞質内でより集中していることを示す例外32を報告しており、これは肺がんPC9細胞で行われた現在の観察と一致しています。著者らの知る限りでは、この研究はヒト肺がん細胞株において低いYAP N/C比を示した最初の研究である。著者らは、PC9細胞においてYAP N/C比が安定している理由は、細胞/核の広がり面積の変動が小さく、PC9細胞の広がりの初期段階での牽引力が低いためかもしれないという仮説を立てている。PC9およびB2B細胞における低YAP N/C比の根底にある分子機構の解剖は進行中である。
拡散の最初の10時間の間に、これら2つの細胞株は、YAP N/C比、細胞牽引、および広がり領域の間に明確な関係を示す(図5)。B2B細胞の場合、より高いYAP N/C比は、より高い細胞および核広がり面積と相関しており(図6A,B)、これは他の正常細胞の報告されたデータと一致している33。興味深いことに、この関係の発生傾向は、記録されたすべてのB2B細胞に一般的に見られるが、この関係の2つの異なる程度(高低)が見出される。同時に拡散および遊走するB2B細胞は、より高いYAP N/C比(2.05 ± 0.32)で、より低い牽引力およびより高い細胞および核拡散面積を示す。広がり、同じ位置にとどまるB2B細胞の場合、それらはより高い牽引力を示し、より低いYAP N / C比(1.74 ± 0.21)でより低い細胞および核広がり面積を示す。これら2つの関係度は、分岐した散在するデータグループに示されています(図6C、D)。文献で報告されているように、胚性線維芽細胞NIH 3T3細胞などの静止正常細胞は、遊走性細胞よりも高い牽引力を有する34。この論文で報告されたデータは、拡散および非遊走B2B細胞が拡散および遊走B2B細胞よりも高い牽引力を印加することを示唆しており、非遊走細胞が基板上で安定化するためには高い牽引が必要であることを示唆している可能性が高い。
さらに、これらのデータは、静止した正常なB2B細胞がより高い核周囲力を生成することを示しているが、他の研究者によって行われた以前の研究は、静止細胞の周囲で生成されたより高い細胞牽引力のみを報告した34,35,36,37。著者らは、実験における移住の本質的な傾向の違いが、これらの矛盾した結果を引き起こす可能性があると考えている。公表された実験では、正方形のマイクロパターニングが、単一細胞の拡散を閉じ込め、遊走を阻害するために使用されていた。細胞が遊走する傾向を有していたかどうかは不明である。遊走性細胞は細胞の周辺で高い牽引力を示すことが多いため38、遊走する傾向のある細胞は、遊走が制限されていても依然として高い周辺牽引力を維持する可能性が高い。本研究では、静止細胞はいかなるマイクロパターンによっても制限されないが遊走しないことから、細胞が非遊走状態を維持する傾向があることを示している。別の可能性は、マイクロパターンによって規定されるセル形状が、焦点接着および牽引力39の分布に影響を与え得ることである。本研究の結果は、マイクロパターニングを閉じ込めることなく生成され、静止細胞の力分布を元の形状で表したものである。
著者らの知る限りでは、正常細胞(マウス胚性線維芽細胞)における核周囲力の発見を具体的に報告した出版物は1つだけであり、核全体に広がるアクチンキャップによって引き起こされる可能性がある40。YAP細胞質から核への転座は、核周囲力の増加と相関している40。関連文献を徹底的に検索しても、癌細胞における核周囲力またはアクチンキャップを報告する出版物は得られなかった。黒色腫癌細胞に関する間接的な研究は、アクチンリム(周囲に位置するが核を覆っていない別の核周囲アクチン組織)が細胞遊走速度を低下させることを実証し41、間接的に核周囲力の存在を示唆した。しかし、直接的な実験データは報告されていない。この研究で、著者らは、PC9細胞とB2B細胞の両方が核周囲の変位と牽引力を示すことを見出した。核周囲勢力の生成メカニズムとその影響は、依然として議論の余地がある。正常細胞では、アクチンキャップが核の形態とクロマチン組織の調節42、核骨格と細胞骨格(LINC)複合体43のリンカーを介して核への局所接着からの機械的シグナルの伝達、および細胞の遊走の調節に役割を果たすことが報告されました44。ラミンA / Cは、アクチンキャップ40、41、42、43、44の形成および破壊に関連している。しかしながら、アクチンキャップが核周囲力を発生させると主張する報告は、アクチンリム40の潜在的な役割を考慮していなかった。癌細胞において、ラミンAの過剰発現はアクチンリムの形成を促進し、癌細胞の遊走を制限する。ラミンBの過剰発現はアクチンリム形成を減少させ、遊走を促進する。核前後の力は、核周囲アクチン組織の存在とラミンAの効果のために、このプロセスに関与している可能性がある。しかし、この研究の結果は、測定された核周囲力またはアクチンキャップの挙動の証拠を示さなかった。したがって、本研究におけるPC9細胞における核周囲力の発見は、肺癌細胞における核周囲力および変位を示す最初の報告である。著者らは現在、CRISPR/Cas9で操作されたPC9細胞とB2B細胞における核周囲力の分子メカニズムと機能を調べている。
この論文で実証されている全光学機械生物学の尋問を超えて、統合された多機能システムは、生命系における無数の他の重要な生理学的および病的生物学的信号を光学的にプローブするために適用することができる。例えば、著者らの研究室は最近、膜電圧指示器QuasAr2(励起:640nm;発光:660nm-740nm)、膜電圧脱偏光子CheRiff(励起:488nm)、および膜電圧過偏光器eNpHR3(励起:590nm)の3つの光応答性膜タンパク質を共発現する複数の安定形質導入ヒト癌細胞株を確立した。これら3つの機能性タンパク質は、スペクトル直交レーザーラインによってクロストークフリーで活性化することができ、膜電気生理学の全光学的双方向シグナル伝達(読み出しおよび制御)を可能にする。著者らは、統合されたオプトエレクトロニクスシステムと手動パッチクランプを使用して、単一のヒトがん細胞および多細胞腫瘍スフェロイドにおける膜電圧(Vm)の全光学制御および読み出しを検証した。全光学電気生理学の調査は、癌細胞における以前はアクセスできなかった生体電気の詳細な探査の可能性を開き、腫瘍生物学を新しい軸から進歩させるのに役立つかもしれない。
The authors have nothing to disclose.
このプロジェクトは、UF Health Cancer Center(X. T. and D. S.)のCancer Pilot AwardとGatorade Award Start-up Package(X. T.)によって財政的に支援されています。著者らは、ジョナサン・リヒト博士(UFHCC)、ロルフ・レンヌ博士(UFHCC)、イ・ジヒョン博士(生物統計学、UF)、ヒュー・ファン博士(MAE、UF)、ウォーレン・ディクソン博士(MAE、UF)、ガトゥ・スバシュ博士(MAE、UF)、マーク・シェプラク博士(MAE & ECE、UF)、マリサ・サルンティノラノント博士(MAE、UF)、スコット・バンクス博士(MAE、 UF)、マシュー・トラウム博士(MAE、UF)、デイビッド・ハーン博士(アリゾナ大学)、ワン・ウェイホン博士(オラクル・コーポレーション)、ユフア・タン博士(香港理工大学)、ニコンのサポートチーム(ホセ・セラノ・ベレス博士、ラリー・コルドン博士、ジョン・エクマン博士)。著者らは、Tang’s、Siemann’s、Guanの研究所のすべてのメンバーと、UFのMAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departmentsのすべてのスタッフからの寛大で効果的な支援に深く感謝している。
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |