Summary

Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Published: September 10, 2021
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Summary

Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.

Abstract

As células gliais provavelmente têm uma implicação considerável na fisiopatologia de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Suas alterações talvez estejam associadas a um estado pró-inflamatório. A linhagem de ratos TgF344-AD foi projetada para expressar genes humanos app e humanos PS1ΔE9 , codificando proteínas amiloides Aβ-40 e Aβ-42 e exibe patologia amiloide e déficits cognitivos com envelhecimento. O modelo de rato TgF344-AD é usado neste estudo para avaliar a origem celular da ligação de 18 kDa translocator protein (TSPO, um marcador de ativação celular gliana) e os níveis de receptor de serotonina 5HT2A receptor (5HT2AR) que são possivelmente interrompidos em DDA. A técnica aqui apresentada é Fluorescência-Ativada Classificação celular para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT), uma técnica quantitativa específica do tipo celular complementar às técnicas in vivo PET ou SPECT ou ex vivo/in vitro autoradiography. Ele quantifica o mesmo rastreador radiolabeled usado antes para a imagem, usando um contador de γ após a triagem de células de citometria. Isso permite determinar a origem celular da proteína radiolabeled com alta especificidade celular e sensibilidade. Por exemplo, estudos com FACS-RTT mostraram que (i) o aumento da ligação TSPO estava associado à microglia em um modelo de ratinaide de lipopolysacarídeo (LPS)-induzido neuroinflamação, (ii) um aumento na ligação TSPO em 12 e 18 meses foi associado primeiro com astrócitos, e depois microglia nos ratos TgF344-AD em comparação com ratos do tipo selvagem (WT) e (iii) a densidade estriatal de 5HT2A R diminui em astrócitos aos 18 meses no mesmo modelo de AD de rato. Curiosamente, essa técnica pode ser estendida a praticamente todos os radiotracers.

Introduction

Doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas por uma perda neuronal associada ao aumento dos sintomas. AD, a causa mais comum de demência, representando 60%-70% dos casos, afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo1. Em um nível neuropatológico, as duas principais características da DA são o acúmulo de placas extracelulares amilóide-β (Aβ) e emaranhados neurofibrilaris Tau intracelulares. Alterações celulares gliais também foram associadas à AD2 e possível interrupção de vários sistemas neurotransmissores 3,4.

A linha de ratos TgF344-AD foi modificada para modelar AD expressando transgenes humanos APP e PS1ΔE9, levando à expressão solúvel e insolúvel Aβ-40 e Aβ-42 e formação de placa amiloide5. Também apresenta o acúmulo de formas hiperfosforilaladas da proteína Tau que levam à tauopatia. Dos 9 a 24 meses, os ratos desenvolvem progressivamente as características patológicas da DA e um comprometimento cognitivode 5,6,7,8,9.

Tomografia de Emissão de Pósitrons (PET), Tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e autoradiografia são técnicas baseadas na emissão e quantificação de raios γ. Os radiotracers são quantificados tanto in vivo (PET e SPECT) quanto ex vivo/in vitro (autoradiografia). Essas técnicas sensíveis têm contribuído para a compreensão de mecanismos de várias doenças cerebrais, como a DA. De fato, em termos de neuroinflamação, há muitos estudos avaliando 18 kDa Translocator Protein (TSPO), um marcador de neuroinflamação in vivo, com rastreadores radiolabeled como [11C]-(R)-PK11195 ou [11C]PBR28 (para revisão ver10). Além disso, alterações nos sistemas neurotransmissores têm sido estudadas utilizando radiotracers 11,12,13.

No entanto, essas técnicas não determinam a origem celular do sinal radioativo. Isso poderia dificultar a interpretação dos fundamentos biológicos da alteração na vinculação de um radiolig e no PET/SPECT. Por exemplo, no caso de estudos tspo de neuroinflamação, entender se o aumento ou diminuição do TSPO é devido a alterações astróciticas ou microgliais é de suma importância. A técnica de Triagem celular ativada pela Fluorescência para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT) foi desenvolvida para contornar esses problemas, permitindo a avaliação da radioligência e vinculação em cada tipo de célula separadamente e a quantificação da densidade de proteína-alvo por célula. Esta técnica inovadora é, consequentemente, complementar e altamente compatível com imagens PET e SPECT.

Aqui, essa técnica foi aplicada ao longo de dois eixos: o estudo da neuroinflamação utilizando radioligands específicos do TSPO e avaliação do sistema serotonérgico. No primeiro eixo, o objetivo era compreender a origem celular do sinal TSPO em resposta a uma reação inflamatória aguda. Portanto, o FACS-RTT foi utilizado nos tecidos cerebrais dos ratos após a indução da neuroinflamação por meio de uma injeção de lipopólise (LPS) e após um estudo de imagem in vivo [125I]CLINDE SPECT. Além disso, o mesmo protocolo de imagem e FACS-RTT foram aplicados em ratos TgF344-AD de 12 e 24 meses de idade e ratos do tipo selvagem (WT) correspondentes. O segundo eixo visava determinar a origem das alterações do sistema serotoninérgico neste modelo de rato através da avaliação de densidade ex vivo 5-HT2AR por tipo de célula.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética para Experimentação Humana e Animal do Cantão de Genebra, a Comissão Cantonnal de Ética em Pesquisa (CCER) e a Direção Geral da Saúde do Cantão de Genebra (Suíça), respectivamente. Os dados são relatados seguindo as diretrizes da Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE). 1. Preparação e calibração da câmera SPECT Ligue a câmera, carregue o software operaci…

Representative Results

Ratos WT experimentaram in vivo SPECT scan com [125I]RADIOtracer CLINDE após uma injeção unilateral de LPS (Figura 2). Esta varredura (utilizando dados somados de imagens de 45-60 min de injeção pós-radiotracer) mostrou maior ligação de [125I]CLINDE no local da injeção de LPS (Figura 2A) do que na região contralateral do cérebro (Figura 2B). As amostras ex vivo que foram submetidas…

Discussion

Para nosso conhecimento, essa técnica foi a primeira a descrever uma abordagem que permite uma melhor compreensão das alterações in vivo de ligação de um radiotracer no nível celular. O protocolo descreve um método multiescala para quantificar a ligação radiotracer no nível celular usando [125I]CLINDE (TSPO) ou [125I]R91150 (5HT2AR) como exemplos.

Esta técnica é robusta e sensível o suficiente para detectar precisamente a origem celular d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsa nº 320030-184713). Os autores BBT e KC são apoiados pela Fundação Velux (projeto nº 1123). A Author ST recebeu apoio da Fundação Nacional de Ciência suíça (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), a Fundação Prof. Dr. Max Cloetta (bolsa de estudos Clínica Medicine Plus) e a Fundação Jean e Madeleine Vachoux.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich
Acetonitrile Sigma-Aldrich
BioVet BioVet Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur University Hospital of Geneva Virucide
Fc Block / anti-CD32 BD Biosciences BDB550270 Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90 Biolegend 202504 Reactivity for rat
Heparin B. Braun B01AB01
HPLC Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm BD Biosciences 321312 24 G catheter
Isoflurane Baxter ZDG9623
Lacryvisc Alcon 2160699
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Micropore soft tape 3M F51DA01
MILabs-Uspect II MILabs Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios Beckman Coulter Cell sorter
Myelin Removal Beads II Miltenyi Biotec 130-096-733 Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution B. Braun 395202
Neural Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet Amazon CMN-0074-10YD 40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
R91150 précursor CERMN
Sep-Pak C18 Column Waters Concentration column
Sodium iodide Na125 PerkinElmer
Tributylin precursor CERMN
U-SPECT Rec2.38c MILabs Version Rec2.38c Software for SPECT images reconstruction
USPECT II MILabs Spect Camera
Wizard 3" PerkinElmer Gamma counter

References

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Cite This Article
Amossé, Q., Ceyzériat, K., Tsartsalis, S., Tournier, B. B., Millet, P. Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal. J. Vis. Exp. (175), e62883, doi:10.3791/62883 (2021).

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