Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) для определения клеточного происхождения радиоактивного сигнала
Summary
Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) является мощным инструментом для изучения роли транслокаторного белка 18 кДа или экспрессии серотонина 5HT2A-рецептора при болезни Альцгеймера в клеточном масштабе. Этот протокол описывает применение EX-vivo FACS-RTT в модели крыс TgF344-AD.
Abstract
Глиальные клетки, вероятно, имеют значительное значение в патофизиологии нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (БА). Их изменения, возможно, связаны с провоспалительным состоянием. Штамм крыс TgF344-AD был разработан для экспрессии человеческих генов APP и ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО PS1ΔE9 , кодирующих амилоидные белки Aβ-40 и Aβ-42 и демонстрирующих амилоидную патологию и когнитивный дефицит со старением. Модель крыс TgF344-AD используется в этом исследовании для оценки клеточного происхождения связывания 18 кДа транслокаторного белка (TSPO, маркер активации глиальных клеток) и уровней рецептора серотонина 5HT2A (5HT2AR), которые, возможно, нарушаются при AD. Метод, представленный здесь, представляет собой флуоресцентно-активированную сортировку клеток в радиолигандную обработанную ткань (FACS-RTT), количественный метод, специфичный для типа клеток, дополняющий методы ауторадиографии in vivo PET или SPECT или ex vivo / in vitro . Он количественно определяет тот же радиоактивный индикатор, который использовался ранее для визуализации, используя счетчик γ после сортировки клеток цитометрии. Это позволяет определить клеточное происхождение меченого радиоактивным путем белка с высокой клеточной специфичностью и чувствительностью. Например, исследования с FACS-RTT показали, что (i) увеличение связывания TSPO было связано с микроглией в крысиной модели нейровоспаления, индуцированного липополисахаридом (LPS), (ii) увеличение связывания TSPO через 12 и 18 месяцев было связано сначала с астроцитами, а затем с микроглией у крыс TgF344-AD по сравнению с крысами дикого типа (WT) и (iii) стриатальной плотностью 5HT2A. R снижается в астроцитах через 18 месяцев в той же модели AD крыс. Интересно, что эта техника может быть распространена практически на все радиоиндикаторы.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (БА), характеризуются потерей нейронов, связанной с усилением симптомов. БА, наиболее распространенная причина деменции, на которую приходится 60-70% случаев, затрагивает около 50 миллионов человек во всем мире1. На нейропатологическом уровне двумя основными характеристиками БА являются накопление внеклеточных амилоидно-β (Aβ) бляшек и внутриклеточных тау-нейрофибриллярных клубков. Изменения глиальных клеток также были связаны с AD2 и возможным нарушением работы нескольких нейротрансмиттерных систем 3,4.
Крысиная линия TgF344-AD была модифицирована для моделирования AD путем экспрессии трансгенов APP и PS1ΔE9 человека, что приводит к растворимой и нерастворимой экспрессии Aβ-40 и Aβ-42 и образованию амилоидных бляшек5. В нем также представлено накопление гиперфосфорилированных форм тау-белка, приводящего к тауопатии. В возрасте 9-24 месяцев у крыс прогрессивно развиваются патологические признаки БА и когнитивные нарушения 5,6,7,8,9.
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и ауторадиография являются методами, основанными на излучении и количественной оценке γ лучей. Радиоиндикаторы количественно определяются либо in vivo (ПЭТ и ОФЭКТ), либо ex vivo/in vitro (ауторадиография). Эти чувствительные методы способствовали пониманию механизмов нескольких заболеваний головного мозга, таких как БА. Действительно, с точки зрения нейровоспаления, существует множество исследований, оценивающих 18 кДа транслокаторного белка (TSPO), маркер нейровоспаления in vivo, с радиомаркированными индикаторами, такими как [11C]-(R)-PK11195 или [11C]PBR28 (для обзора см.10). Кроме того, изменения нейротрансмиттерных систем были изучены с использованием радиоиндикаторов 11,12,13.
Однако эти методы не определяют клеточное происхождение радиоактивного сигнала. Это может затруднить интерпретацию биологических основ изменения в связывании радиолиганда в ПЭТ/ОФЭКТ. Например, в случае исследований нейровоспаления TSPO, понимание того, связано ли увеличение или уменьшение TSPO с астроцитарными или микроглиальными изменениями, имеет первостепенное значение. Для обхода этих проблем был разработан метод флуоресцентно-активированной сортировки клеток в ткань, обработанную радиоактивными лигандами (FACS-RTT), позволяющий оценить связывание радиолигандов в каждом типе клеток отдельно и количественно оценить плотность целевого белка на клетку. Следовательно, этот инновационный метод дополняет и высоко совместим с визуализацией ПЭТ и ОФЭКТ.
Здесь эта методика применялась по двум осям: изучение нейровоспаления с использованием TSPO-специфических радиолигандов и оценка серотонинергической системы. На первой оси цель состояла в том, чтобы понять клеточное происхождение сигнала TSPO в ответ на острую воспалительную реакцию. Поэтому FACS-RTT использовали на тканях мозга крыс после индукции нейровоспаления с помощью инъекции липополисахарида (ЛПС) и после исследования визуализации in vivo [125I]CLINDE SPECT. Кроме того, та же визуализация и протокол FACS-RTT были применены к 12- и 24-месячным крысам TgF344-AD и соответствующим крысам дикого типа (WT). Вторая ось была направлена на определение происхождения изменений серотонинергической системы в этой модели крыс с помощью оценки плотности ex vivo 5-HT2AR по типу клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Насколько нам известно, этот метод был первым, который описал подход, который позволяет лучше понять изменения связывания in vivo радиоиндикатора на клеточном уровне. Протокол описывает многомасштабный метод количественной оценки связывания радиоиндикатора на клеточном уровне с и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (грант No 320030-184713). Авторы ББТ и КС поддерживаются Фондом Velux (проект No 1123). Автор ST получил поддержку от Швейцарского национального научного фонда (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Фонд профессора доктора Макса Клоэтты (стипендия Clinical Medicine Plus) и Фонд Жана и Мадлен Вашу.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 4, 575-590 (2018).
- D’Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer’s disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D’Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer’s disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer’s disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer’s disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer’s disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
