Summary

الأنسجة المعالجة بالفرز الإشعاعي للخلايا المنشطة بالتألق (FACS-RTT) لتحديد الأصل الخلوي للإشارة المشعة

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

يعد النسيج المعالج بالفلور المنشط للخلايا المشعة (FACS-RTT) أداة قوية لدراسة دور بروتين نقل 18 kDa أو تعبير مستقبلات السيروتونين 5HT 2A في مرض الزهايمر على نطاقخلوي. يصف هذا البروتوكول التطبيق السابق للجسم الحي ل FACS-RTT في نموذج الفئران TgF344-AD.

Abstract

من المحتمل أن يكون للخلايا الدبقية تأثير كبير في الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD). ربما ترتبط تعديلاتها بحالة مؤيدة للالتهابات. تم تصميم سلالة الفئران TgF344-AD للتعبير عن جينات APP البشرية و PS1ΔE9 البشرية ، وترميز بروتينات الأميلويد Aβ-40 و Aβ-42 ويعرض أمراض الأميلويد والعجز المعرفي مع الشيخوخة. يستخدم نموذج الفئران TgF344-AD في هذه الدراسة لتقييم الأصل الخلوي لبروتين نقل 18 kDa (TSPO ، وهو علامة على تنشيط الخلايا الدبقية) ، ومستويات مستقبلات السيروتونين 5HT 2A (5HT2A R) التي قد تتعطل فيAD. التقنية المعروضة هنا هي فرز الخلايا المنشط بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند الإشعاعي (FACS-RTT) ، وهي تقنية كمية خاصة بنوع الخلية مكملة لتقنيات التصوير الشعاعي الذاتي في الجسم الحي أو SPECT أو خارج الجسم الحي / في المختبر. وهو يحدد كميا نفس المقتفي المشع المستخدم سابقا للتصوير ، باستخدام عداد γ بعد فرز خلايا قياس الخلايا. هذا يسمح بتحديد الأصل الخلوي للبروتين الموسوم إشعاعيا مع خصوصية وحساسية خلوية عالية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات التي أجريت على FACS-RTT أن (i) الزيادة في ارتباط TSPO ارتبطت بالخلايا الدبقية الصغيرة في نموذج الفئران من التهاب الأعصاب الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، (ii) ارتبطت الزيادة في ارتباط TSPO في 12 و 18 شهرا بالخلايا النجمية أولا ، ثم الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران TgF344-AD مقارنة بالفئران من النوع البري (WT) ، و (iii) الكثافة المخططة ل 5HT2A R ينخفض في الخلايا النجمية في 18 شهرا في نفس نموذج AD الفئران. ومن المثير للاهتمام ، يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل جميع أجهزة التتبع الإشعاعي تقريبا.

Introduction

تتميز الأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD) ، بفقدان الخلايا العصبية المرتبطة بزيادة الأعراض. مرض الزهايمر ، السبب الأكثر شيوعا للخرف ، وهو ما يمثل 60٪ -70٪ من الحالات ، يؤثر على حوالي 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. على المستوى العصبي المرضي ، فإن الخاصيتين الرئيسيتين ل AD هما تراكم لويحات β أميلويد خارج الخلية (Aβ) وتشابك تاو العصبي الليفي داخل الخلايا. كما ارتبطت تغيرات الخلايا الدبقية ب AD2 واحتمال تعطيل العديد من أنظمة الناقلات العصبية 3,4.

تم تعديل خط الفئران TgF344-AD إلى نموذج AD من خلال التعبير عن الجينات المحورة البشرية APP و PS1ΔE9 ، مما يؤدي إلى تعبير Aβ-40 و Aβ-42 القابل للذوبان وغير القابل للذوبان وتكوين لوحة الأميلويد5. كما أنه يعرض تراكم أشكال فرط الفوسفوريلات من بروتين تاو مما يؤدي إلى اعتلال تاووباثي. من سن 9-24 شهرا ، تطور الفئران تدريجيا السمات المميزة المرضية لمرض الزهايمر وضعف إدراكي5،6،7،8،9.

التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، والتصوير المقطعي المحوسب بالإصدار أحادي الفوتون (SPECT) ، والتصوير الشعاعي الذاتي هي تقنيات تعتمد على انبعاث الأشعة γ وتحديدها كميا. يتم تحديد كميا المقتفيات الإشعاعية إما في الجسم الحي (PET و SPECT) أو خارج الجسم الحي / في المختبر (التصوير الشعاعي الذاتي). وقد ساهمت هذه التقنيات الحساسة في فهم آليات العديد من أمراض الدماغ، مثل مرض الزهايمر. في الواقع ، من حيث الالتهاب العصبي ، هناك الكثير من الدراسات التي تقيم 18 kDa Translocator Protein (TSPO) ، وهي علامة التهاب عصبي في الجسم الحي ، مع مقتفيات ذات علامات إشعاعية مثل [11 C]-(R)-PK11195 أو [11C]PBR28 (للمراجعة انظر 10). بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تعديلات أنظمة الناقلات العصبية باستخدام المقتفيات الإشعاعية11،12،13.

غير أن هذه التقنيات لا تحدد المنشأ الخلوي للإشارة المشعة. وهذا يمكن أن يعوق تفسير الأسس البيولوجية للتغيير في ربط الرباط المشع في PET/SPECT. على سبيل المثال ، في حالة دراسات TSPO للالتهاب العصبي ، فإن فهم ما إذا كانت زيادة أو نقصان TSPO ناتجة عن التغيرات النجمية أو الدبقية الدقيقة له أهمية قصوى. تم تطوير تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند المشع (FACS-RTT) للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسمح بتقييم ربط الرباط الإشعاعي في كل نوع من أنواع الخلايا على حدة وتحديد كثافة البروتين المستهدف لكل خلية. وبالتالي فإن هذه التقنية المبتكرة مكملة ومتوافقة للغاية مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير التصويري بالأشعة تحت الحمراء.

هنا ، تم تطبيق هذه التقنية على طول محورين: دراسة التهاب الأعصاب باستخدام الرباط الإشعاعي الخاص ب TSPO وتقييم نظام السيروتونين. في المحور الأول ، كان الهدف هو فهم الأصل الخلوي لإشارة TSPO استجابة لتفاعل التهابي حاد. لذلك ، تم استخدام FACS-RTT على أنسجة المخ للفئران بعد تحريض الالتهاب العصبي عن طريق حقن عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبعد دراسة تصوير في الجسم الحي [125I] Clinde Spect. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس بروتوكول التصوير و FACS-RTT على الفئران TgF344-AD التي يبلغ عمرها 12 و 24 شهرا والفئران المطابقة من النوع البري (WT). يهدف المحور الثاني إلى تحديد أصل تعديلات نظام السيروتونين في نموذج الفئران هذا عن طريق تقييم كثافة الجسم الحي 5-HT2AR حسب نوع الخلية.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع لجنة أخلاقيات التجارب البشرية والحيوانية في كانتون جنيف، ولجنة الكانتون لأخلاقيات البحوث، والإدارة العامة للصحة في كانتون جنيف (سويسرا)، على التوالي. يتم الإبلاغ عن البيانات وفقا لإرشادات البحوث الحيوانية: الإبلاغ عن التجارب داخل الجسم الح…

Representative Results

الفئران WT من ذوي الخبرة في الجسم الحي SPECT المسح الضوئي مع [125I]CLINDE المقتفي الإشعاعي بعد حقن LPS من جانب واحد (الشكل 2). أظهر هذا المسح الضوئي (باستخدام بيانات مجمعة من صور 45-60 دقيقة بعد حقن التتبع الإشعاعي) ارتباطا أعلى ل [125I]CLINDE في موقع حقن LPS (الشكل 2A) مقارنة بالمن…

Discussion

على حد علمنا ، كانت هذه التقنية هي الأولى التي تصف نهجا يسمح بفهم أفضل لتعديلات الربط في الجسم الحي للمقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي. يصف البروتوكول طريقة متعددة المقاييس لقياس ارتباط المقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي باستخدام [125 I] CLINDE (TSPO) أو [125I]R91150 (5HT2AR) كأمثل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة رقم 320030-184713). يتم دعم المؤلفين BBT و KC من قبل مؤسسة Velux (المشروع رقم 1123). تلقى المؤلف ST الدعم من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة التنقل المبكرة بعد الدكتوراه ، لا. P2GEP3_191446) ، ومؤسسة البروفيسور الدكتور ماكس كلويتا (منحة الطب السريري بلس) ، ومؤسسة جان ومادلين فاتشو.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich
Acetonitrile Sigma-Aldrich
BioVet BioVet Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur University Hospital of Geneva Virucide
Fc Block / anti-CD32 BD Biosciences BDB550270 Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90 Biolegend 202504 Reactivity for rat
Heparin B. Braun B01AB01
HPLC Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm BD Biosciences 321312 24 G catheter
Isoflurane Baxter ZDG9623
Lacryvisc Alcon 2160699
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Micropore soft tape 3M F51DA01
MILabs-Uspect II MILabs Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios Beckman Coulter Cell sorter
Myelin Removal Beads II Miltenyi Biotec 130-096-733 Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution B. Braun 395202
Neural Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet Amazon CMN-0074-10YD 40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
R91150 précursor CERMN
Sep-Pak C18 Column Waters Concentration column
Sodium iodide Na125 PerkinElmer
Tributylin precursor CERMN
U-SPECT Rec2.38c MILabs Version Rec2.38c Software for SPECT images reconstruction
USPECT II MILabs Spect Camera
Wizard 3" PerkinElmer Gamma counter

References

  1. Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
  2. Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 4, 575-590 (2018).
  3. D’Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer’s disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
  4. D’Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer’s disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
  5. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  6. Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer’s disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
  7. Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer’s disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
  8. Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer’s disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
  9. Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
  10. Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
  12. Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
  13. Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
  14. Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
  15. Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
  16. Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).

Play Video

Cite This Article
Amossé, Q., Ceyzériat, K., Tsartsalis, S., Tournier, B. B., Millet, P. Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal. J. Vis. Exp. (175), e62883, doi:10.3791/62883 (2021).

View Video