Summary

חיסון חופשי של מוחות עכבר

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

Abstract

הכתמת אימונוהיסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה שגרתית הנפוצה במדעי המוח כדי לחקור מנגנונים מרכזיים שבבקרה את ויסות חילוף החומרים של האנרגיה ותהליכים נוירוביולוגיים אחרים. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין מעבדות. עבור כל ניסוי מכתים, יש צורך לייעל את ההליכים העיקריים המבוססים על הבדלים בין מינים, רקמות, חלבונים ממוקדים ותנאי העבודה של ריאגנטים. מאמר זה מדגים זרימת עבודה אמינה בפירוט, כולל זלוף תוך-בתחום, חתך מוחי, חיסון צף חופשי, הרכבת רקמות והדמיה, אשר ניתן לעקוב בקלות על ידי חוקרים בתחום זה.

כמו כן נדונים כיצד לשנות נהלים אלה כדי לספק את הצרכים האישיים של החוקרים. כדי להמחיש את האמינות והיעילות של פרוטוקול זה, רשתות פרינורונאליות הוכתמו עם ביוטין תווית ויסטריה florbunda agglutinin (WFA) ו ארגינין וזופרסין (AVP) עם נוגדן אנטי AVP במוח העכבר. לבסוף, הפרטים הקריטיים עבור ההליך כולו טופלו, ואת היתרונות של פרוטוקול זה לעומת אלה של פרוטוקולים אחרים. יחד, מאמר זה מציג פרוטוקול ממוטב לחיסון חופשי של רקמת מוח העכבר. בעקבות פרוטוקול זה מקל על מדענים זוטרים ובכירים כאחד לשפר את האיכות, האמינות והשחזור של מחקרים חיסוניים.

Introduction

השכיחות של השמנת יתר ותחלואה נלווית הגיעה לרמות מגיפה, גרימת נטל חברתי-כלכלי עצום1,2. מודלים עכבר שונים פותחו כדי להבין טוב יותר את התהליכים הביולוגיים האחראים להשמנת יתר3,4. מכיוון שמנגנונים מרכזיים חשובים לוויסות הומאוסטזיס אנרגטי במודלים אלה של בעלי חיים, מחקרים נוירואנטומיים של מוחות עכברים הפכו לטכניקה הכרחית בתחום זה. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של טכניקות היסטולוגיה במוח משתנות במידה ניכרת בין מעבדות ואפילו חוקרים באותה מעבדה מסיבות שונות (למשל, נוגדנים, רקמות, טיפולים, מינים, מטרות מחקר). לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול כללי למחקרים היסתולוגיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. בינתיים, מתחילים יכולים ללמוד במהירות, לשלוט ולהתאים פרוטוקול זה כדי לספק את הצרכים האישיים שלהם.

כתמים אימונוהיסטוכימיים היא שיטה מבוססת כי נעשה שימוש נרחב כדי לדמיין סוגי תאים ספציפיים, mRNAs, וחלבונים במגוון רחב של רקמות (למשל, המוח ורקמות היקפיות)5,6. ליתר דיוק, אנטיגן של עניין יכול להיות מתויג על ידי נוגדן ראשוני מסוים נוגדן משני מתאים מקושר אנזים (למשל, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית) או צבע פלואורסצנטי (פלואורסצין איזוטיוצינט)6. כדוגמה לתועלת של טכניקות אלה, β-אנדורפין [פפטיד אחד מקודד על ידי פרו-אופיומלאנוקורטין (POMC)] ו- c-fos (סמן של פעילות עצבית) הוכתמו בגרעין הארקואט. מחיקה של טריפטופן הידרוקסילאז 2 (אנזים אינטגרלי לסינתזת סרוטונין) בגרעין raphe גבית תורסאלי הוכח להקטין ביטוי c-fos נוירונים POMC בגרעין arcuate7. בנוסף, ההפצה של mRNA קולטן ויטמין D מופה במוח העכבר באמצעות הכלאה במקום (RNAscope)8. מאמר זה מציג שיטה אמינה ויעילה עם זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור חיסון צף חופשי, במטרה לשפר את האיכות ואת הרבייה של מחקרים היסטולוגיים של מוח העכבר.

Protocol

C57BL / 6J עכברים משני המינים (8-16 שבועות של גיל) שימשו במחקר הנוכחי. טיפול בכל בעלי החיים וכל ההליכים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור. 1. זלוף הערה: שלבים 1.1 – 1.6 מבוצעים במכסה אדים. הרדמה יוצקים 5 מ”ל של איזופלוראן (ראה <str…

Representative Results

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מומחש בקצרה באיור 1. הליך ההקפאה של מעבדה זו מוצג באיור 2A, שבו 5 דגימות מוח נותחו בו זמנית. ההרכבה של מקטעי המוח מוצגת באיור 2B, ושקופית המותקנת במלואה עם מקטעי מוח מודגמת באיור 2C. באיור 3</st…

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת למחקרים נוירואנטומיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך רקמות, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. עם זאת, יש למטב כמה פרטים מרכזיים החיוניים לתוצאות עקביות ואמינות.

איכות הזלוף היא קריטית להכתמת מוצלחות. כתמי תוצאות עשויים להיות מושפעים אם הדם …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

החוקרים נתמכו על ידי מענקים מה- NIH (K01DK119471 ל- CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, ו- R01DK120858 ל- YX), USDA / CRIS (51000-064-01S ל- YX) ומלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (#829565) ל- LT.

Materials

Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Play Video

Cite This Article
Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

View Video