Summary

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Abstract

La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.

También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.

Introduction

La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga socioeconómica1,2. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de las técnicas de histología cerebral varían considerablemente entre los laboratorios e incluso los investigadores dentro del mismo laboratorio por diversas razones (por ejemplo, anticuerpos, tejidos, tratamientos, especies, objetivos de investigación). Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo general para los estudios histológicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Mientras tanto, los principiantes pueden aprender, dominar y ajustar rápidamente este protocolo para satisfacer sus necesidades individuales.

La tinción inmunohistoquímica es un método establecido que se ha utilizado ampliamente para visualizar tipos específicos de células, ARNm y proteínas en una variedad de tejidos (por ejemplo, tejido cerebral y periférico)5,6. Más específicamente, un antígeno de interés puede ser marcado por un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario correspondiente vinculado a una enzima (por ejemplo, inmunohistoquímica cromogénica) o un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína)6. Como ejemplo de la utilidad de estas técnicas, β-endorfina [un péptido codificado por pro-opiomelanocortina (POMC)] y c-fos (un marcador de actividad neuronal) se tiñeron en el núcleo arqueado. Se demostró que la deleción de triptófano hidroxilasa 2 (una enzima integral a la síntesis de serotonina) en el núcleo dorsal del rafe disminuye la expresión de c-fos en las neuronas POMC en el núcleo arqueado7. Además, se mapeó la distribución del ARNm del receptor de vitamina D en el cerebro del ratón mediante hibridación in situ (RNAscope)8. Este artículo presenta un método confiable y eficiente con un flujo de trabajo paso a paso para la inmunotinción flotante, con el objetivo de mejorar la calidad y la reproducibilidad de los estudios histológicos del cerebro del ratón.

Protocol

En el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos (8-16 semanas de edad). El cuidado de todos los animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine. 1. Perfusión NOTA: Los pasos 1.1 a 1.6 se realizan en una campana extractora de humos. Anestesia Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales</strong…

Representative Results

El diagrama de flujo de este protocolo se ilustra brevemente en la Figura 1. El procedimiento de crioseccionamiento de este laboratorio se demuestra en la Figura 2A, en la que se seccionaron 5 muestras de cerebro simultáneamente. El montaje de las secciones cerebrales se muestra en la Figura 2B, y una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales se ilustra en la Figura 2C. En <strong clas…

Discussion

Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.

La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los investigadores fueron apoyados por subvenciones de los NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 y R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) y American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.

Materials

Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

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Cite This Article
Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

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