Summary

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Abstract

Immunohistochemische kleuring van muizenhersenen is een routinetechniek die vaak wordt gebruikt in de neurowetenschappen om centrale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de regulatie van het energiemetabolisme en andere neurobiologische processen. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histologische resultaten van de hersenen kan echter variëren tussen laboratoria. Voor elk kleuringsexperiment is het noodzakelijk om de belangrijkste procedures te optimaliseren op basis van verschillen in soorten, weefsels, gerichte eiwitten en de werkomstandigheden van de reagentia. Dit artikel demonstreert een betrouwbare workflow in detail, inclusief intra-aortaperfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselmontage en beeldvorming, die gemakkelijk kan worden gevolgd door onderzoekers op dit gebied.

Ook wordt besproken hoe deze procedures kunnen worden aangepast om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Om de betrouwbaarheid en efficiëntie van dit protocol te illustreren, werden perineuronale netten gekleurd met biotine-gelabelde Wisteria florbunda agglutinin (WFA) en arginine vasopressine (AVP) met een anti-AVP-antilichaam in de muizenhersenen. Ten slotte zijn de kritieke details voor de hele procedure behandeld en de voordelen van dit protocol ten opzichte van die van andere protocollen. Alles bij elkaar presenteert dit artikel een geoptimaliseerd protocol voor vrij zwevende immunostaining van hersenweefsel van muizen. Het volgen van dit protocol maakt dit proces gemakkelijker voor zowel junior als senior wetenschappers om de kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van immunostainingstudies te verbeteren.

Introduction

De prevalentie van obesitas en bijbehorende comorbiditeiten heeft epidemische niveaus bereikt, wat een enorme sociaaleconomische last veroorzaakt1,2. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om de biologische processen die verantwoordelijk zijn voor obesitas beter te begrijpen3,4. Omdat centrale mechanismen belangrijk zijn voor de regulatie van energiehomeostase in deze diermodellen, zijn neuroanatomische studies van muizenhersenen een noodzakelijke techniek op dit gebied geworden. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histologietechnieken in de hersenen variëren echter aanzienlijk tussen laboratoria en zelfs onderzoekers binnen hetzelfde laboratorium om verschillende redenen (bijv. Antilichamen, weefsels, behandelingen, soorten, onderzoeksdoelstellingen). Daarom is het noodzakelijk om een algemeen protocol vast te stellen voor histologische studies van de hersenen van muizen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Ondertussen kunnen beginners dit protocol snel leren, beheersen en aanpassen om aan hun individuele behoeften te voldoen.

Immunohistochemische kleuring is een gevestigde methode die op grote schaal is gebruikt om specifieke celtypen, mRNA’s en eiwitten in verschillende weefsels (bijv. Hersenen en perifere weefsels) te visualiseren5,6. Meer specifiek kan een interessant antigeen worden gelabeld door een specifiek primair antilichaam en een overeenkomstig secundair antilichaam gekoppeld aan een enzym (bijvoorbeeld chromogene immunohistochemie) of een fluorescerende kleurstof (fluoresceïne-isothiocyanaat)6. Als voorbeeld van het nut van deze technieken werden β-endorfine [één peptide gecodeerd door pro-opiomelanocortine (POMC)] en c-fos (een marker van neuronale activiteit) gekleurd in de boogvormige kern. Deletie van tryptofaanhydroxylase 2 (een enzym dat integraal deel uitmaakt van de serotoninesynthese) in de dorsale raphe-kern bleek de c-fos-expressie in POMC-neuronen in de boogvormige kern7 te verminderen. Daarnaast werd de verdeling van vitamine D-receptor mRNA in het muizenbrein in kaart gebracht via in situ hybridisatie (RNAscope)8. Dit artikel presenteert een betrouwbare en efficiënte methode met een stapsgewijze workflow voor vrij zwevende immunostaining, met als doel de kwaliteit en reproduceerbaarheid van histologische studies van het muizenbrein te verbeteren.

Protocol

C57BL/6J muizen van beide geslachten (8-16 weken oud) werden gebruikt in de huidige studie. De verzorging van alle dieren en alle procedures werden goedgekeurd door de institutional animal care and use committees van Baylor College of Medicine. 1. Perfusie OPMERKING: Stappen 1.1 – 1.6 worden uitgevoerd in een zuurkast. Anesthesie Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de …

Representative Results

Het stroomschema van dit protocol wordt kort geïllustreerd in figuur 1. De cryosectieprocedure van dit laboratorium is aangetoond in figuur 2A, waarbij 5 hersenmonsters tegelijkertijd werden gesneden. De montage van hersensecties is weergegeven in figuur 2B en een volledig gemonteerde dia met hersensecties is geïllustreerd in figuur 2C. In figuur 3, representatieve fluore…

Discussion

Dit protocol biedt een gevestigde methode voor neuroanatomische studies van de muizenhersenen, waaronder perfusie, weefselsectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Een paar belangrijke details die essentieel zijn voor consistente en betrouwbare resultaten moeten echter worden geoptimaliseerd.

De kwaliteit van de perfusie is van cruciaal belang voor een succesvolle kleuring. Kleuringsresultaten kunnen worden beïnvloed als er bloed in de hersenen achterblijft, aangezi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De onderzoekers werden ondersteund door subsidies van de NIH (K01DK119471 aan CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 en R01DK120858 tot YX), USDA/CRIS (51000-064-01S tot YX) en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) tot LT.

Materials

Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Play Video

Cite This Article
Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

View Video