الطفو الحر مناعة أدمغة الفأر
Summary
يصف هذا البروتوكول نهجا فعالا وقابلا للاستنساخ للدراسات النسيجية للدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتأنيم المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير.
Abstract
تلطيخ المناعي الكيميائية من أدمغة الفئران هو تقنية روتينية تستخدم عادة في علم الأعصاب للتحقيق في الآليات المركزية الكامنة وراء تنظيم استقلاب الطاقة وغيرها من العمليات العصبية البيولوجية. ومع ذلك، قد تختلف جودة وموثوقية والاستنساخ لنتائج الأنسجة الدماغية بين المختبرات. لكل تجربة تلطيخ ، من الضروري تحسين الإجراءات الرئيسية استنادا إلى الاختلافات في الأنواع والأنسجة والبروتينات المستهدفة وظروف عمل الكواشف. توضح هذه الورقة سير عمل موثوق به بالتفصيل ، بما في ذلك التشوه داخل الأبهر ، وتفتيت الدماغ ، والتشبع المناعي العائم ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير ، والتي يمكن متابعتها بسهولة من قبل الباحثين في هذا المجال.
كما تناقش كيفية تعديل هذه الإجراءات لتلبية الاحتياجات الفردية للباحثين. لتوضيح موثوقية وكفاءة هذا البروتوكول ، كانت الشباك العجان ملطخة بالوستاريا فلوربوندا أغغلوتينين (WFA) وأرجينين فاسوبريسين (AVP) مع مضاد مضاد ل AVP في دماغ الماوس. وأخيرا، تمت معالجة التفاصيل الهامة للإجراء بأكمله، ومزايا هذا البروتوكول مقارنة بمزايا البروتوكولات الأخرى. تقدم هذه الورقة مجتمعة بروتوكولا محسنا لاحتواء المناعة العائمة الحرة لأنسجة دماغ الماوس. إن اتباع هذا البروتوكول يجعل هذه العملية أسهل لكل من العلماء المبتدئين وكبار العلماء لتحسين جودة وموثوقية واستنساخ دراسات التضمين المناعي.
Introduction
وقد بلغ انتشار السمنة والأمراض المصاحبة لها مستويات وبائية، مما تسبب في عبء اجتماعي واقتصادي هائل1،2. وقد تم تطوير نماذج الماوس المختلفة لفهم أفضل للعمليات البيولوجية المسؤولة عن السمنة3،4. لأن الآليات المركزية مهمة لتنظيم التوازن الطاقة في هذه النماذج الحيوانية، أصبحت الدراسات التشريحية العصبية من أدمغة الفئران تقنية ضرورية في هذا المجال. ومع ذلك، تختلف جودة وموثوقية واستنساخ تقنيات الأنسجة الدماغية بشكل كبير بين المختبرات وحتى الباحثين داخل المختبر نفسه لأسباب مختلفة (مثل الأجسام المضادة والأنسجة والعلاجات والأنواع وأهداف البحث). لذلك ، من الضروري وضع بروتوكول عام للدراسات النسيجية لدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. وفي الوقت نفسه، يمكن للمبتدئين تعلم بسرعة، وإتقان، وضبط هذا البروتوكول لتلبية احتياجاتهم الفردية.
تلطيخ Immunohistochemical هو طريقة راسخة التي تم استخدامها على نطاق واسع لتصور أنواع محددة من الخلايا، ورنا، والبروتينات في مجموعة متنوعة من الأنسجة (مثل الدماغ والأنسجة الطرفية)5،6. وبشكل أكثر تحديدا، يمكن تسمية مستضد الاهتمام بأجسام مضادة أولية محددة وأجسام مضادة ثانوية مقابلة مرتبطة إنزيم (مثل الكيمياء المناعية الكروموجينية) أو صبغة فلورية (الفلوريسين إيزوثيوسيانات)6. وكمثال على فائدة هذه التقنيات، كان β-إندورفين [ببتيد واحد مشفر بواسطة الموالية للأوبيوميلانوكرتيين (POMC)] وc-fos (علامة على نشاط الخلايا العصبية) ملطخة في نواة arcuate. وقد تبين حذف هيدروكسيلولاز التربتوفان 2 (إنزيم جزء لا يتجزأ من تخليق السيروتونين) في نواة رابي الظهرية لتقليل التعبير ج فوس في الخلايا العصبية POMC في النواة arcuate7. وبالإضافة إلى ذلك، تم تعيين توزيع مستقبلات فيتامين (د) مرنا في دماغ الماوس عن طريق التهجين في الموقع (RNAscope)8. تقدم هذه الورقة طريقة موثوقة وفعالة مع سير عمل خطوة بخطوة لاحتواء المناعة العائمة مجانا ، بهدف تحسين جودة واستنساخ الدراسات النسيجية لدماغ الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة للدراسات التشريحية العصبية لدماغ الفأر ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الأنسجة ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. ومع ذلك، يجب تحسين بعض التفاصيل الأساسية اللازمة لتحقيق نتائج متسقة وموثوقة.
نوعية التشوه أمر بالغ الأهمية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم المحققون بمنح من المعاهد القومية للصحة (K01DK119471 إلى CW؛ و19971 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK19471 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK119471 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK1 P01DK113954, R01DK115761، R01DK117281، R01DK125480، وR01DK120858 إلى YX)، وزارة الزراعة الأمريكية / CRIS (51000-064-01S إلى YX)، وزمالة ما بعد الدكتوراه جمعية القلب الأمريكية (#829565) إلى LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
