이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.
그들의 활동을 조작하여 유전자의 기능을 추론하는 것은 대부분의 생물학 프로세스의 유전 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다. 분자 미생물학의 발전은 유전자의 조작을 위한 다양한 돌연변이 발생 기술의 출현을 보았습니다. 그 중에서도, 트랜스포슨 삽입 시퀀싱(Tn-seq)은 무표적 방식으로 많은 후보 유전자의 기능을 동시에 평가하는 귀중한 도구이다. 이 기술은 여러 병원성 미생물과 몇 가지 유익한 공생에서 진핵 호스트의 식민지화를 위한 분자 메커니즘을 식별하는 열쇠가 되었습니다.
여기서 Tn-seq는 딱정벌레 라그리아 빌로사의상호 적인 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 식민지 화 요인을 식별하는 방법으로 설립된다. 인주에 의해, Tn5 트랜스포손 매개 삽입항생제 내성 카세트는 B. gladioli의무작위 게놈 위치에서 수행된다. 딱정벌레 숙주를 식민지화하는 박테리아의 능력에 대한 유전자 중단의 효과를 확인하기 위해 생성된 B. gladioli 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 딱정벌레 계란에 접종되고, 액체 배양 배지에서 체외에서 대조군이 성장한다. 식민지화에 충분한 시간을 허용한 후, DNA는 생체 내 및 체외 재배 라이브러리에서 추출됩니다. DNA 라이브러리 준비 프로토콜에 따라 DNA 샘플은 트랜스포슨 삽입 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 트랜스포슨 삽입 가장자리와 측면 세균 DNA를 포함하는 DNA 단편이 선택되고, 돌연변이 부위는 트랜스포슨 삽입 가장자리에서 멀리 시퀀싱하여 결정된다. 마지막으로, 생체 내 및 체외 라이브러리 사이의 각 돌연변이의 주파수를 분석하고 비교함으로써 딱정벌레 식민지 화 시 특정 공생 유전자의 중요성을 예측할 수 있습니다.
버크홀더리아 글래디올리는 라그리아 빌로사 딱정벌레와의 공생 적대적 인 교제에 종사 할 수 있으며, 곤충 호스트4,5,6의미생물 길항제에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 암컷 딱정벌레는 생식 계통에 특화된 땀샘 부속품에 B. gladioli의 몇몇 긴장을 수용합니다. 계란 누워시, 암컷은 B. gladioli에 의해 생성된 항균 화합물이 내모병원성 곰팡이4,6에의한 감염을 억제하는 계란 표면에 B. gladioli 세포를 얼룩지게 한다. 늦은 배아 발달 도중 또는 애벌레 부화 후에 일찌기, 박테리아는 애벌레의 등지 표면에 자구성 질을 식민지화합니다. 공생의 이러한 특수국화 및 수직 전송 경로에도 불구하고, L. villosa는 아마도 환경4에서수평으로 B. gladioli를 취득할 수 있습니다. 또한, B. gladioli의 적어도 3개의 긴장은 L. villosa4와관련하여,6. 이 중, B. gladioli Lv-StA는 시험관 내에서재배할 수 있는 유일한 사람입니다.
B. 라디올리 Lv-StA는 8.56 Mb6의 게놈 크기를 가지고 있으며 7,468개의 유전자를 함유하고 있습니다. 이 유전자의 어떤 딱정벌레 호스트를 식민지로 B. gladioli 박테리아에 대 한 중요 한? 이 질문에 대답하기 위해, 우리는 조건부 필수 미생물 유전자1,2,3을식별하는 탐색 적 방법 인 트랜스포손 삽입 시퀀싱 (Tn-seq)을 사용했습니다. B. gladioli Lv-StA의 돌연변이 라이브러리는 Tn5 트랜스포슨을 사용하여 만들어졌습니다. 대장균 기증자 세포로부터 B. gladioli Lv-StA로 의 결합을 통해 Tn5 트랜스포손과 반전된 반복에 의해 측면에 있는 항생제 내성 카세트를 운반하는 pRL27 플라스미드가 전송되었다(도1). 이에 따라 3,736개의 공생 유전자의 중단을 개별적으로 전달하는 돌연변이 세트가 생성되었다(그림2).
돌연변이 풀은 딱정벌레 계란에 감염되어 식민지 인자를 식별하고, 대조군으로서, 또한 킹스 B (KB) 배지에서 시험관내에서 성장하였다. 식민지화를 위한 충분한 시간을 허용한 후에, 부화한 애벌레는 DNA 추출을 위해 집합되고 풀화되었습니다. B. gladioli Lv-StA의 트랜스포슨 삽입 및 측면 게놈 영역을 포함하는 DNA의 단편은 시퀀싱을 위한 수정된 DNA 라이브러리 준비 프로토콜을 사용하여 선택되었다. 읽기 품질 처리 에 따른 DESeq2 분석은 알 표면을 통해 전송될 때 L. villosa 애벌레를 식민지화하기 위하여 B. gladioli Lv-StA에 중요한 특정 유전자를 확인하기 위하여 실행되었습니다.
B. gladioli 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 L. villosa 딱정벌레와 B. gladioli 박테리아 사이의 공생 상호 작용에서 중요한 호스트 식민지 화 요인을 식별하기 위해 생성되었다. 프로토콜의 주요 단계는 연상, 호스트 감염, DNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱이었습니다.
버크홀더리아의 많은 변종은24,25,트랜스포손 및 항생제 삽입 카세트를 운반하는 플라스미드가 대장균으로부터표적 B. gladioli Lv-StA 균주에 성공적으로 접합되었다. 전기포이션에 의한 이전의 변환 시도는 거의 B. gladioli 변압제로 매우 낮게 산출되었습니다. 많은 수의 변압제를 효율적으로 산출하기 위해 대상 유기체의 변형 기술을 최적화하는 것이 좋습니다.
한 라운드의 컨쥬게이션과 40개의 연상 반점은 B. gladioli Lv-StA에서 3,736개의 유전자를 중단시켰습니다. 뒤늦게, 인후의 여러 라운드는 7,468개의 유전자의 대부분을 중단하고 포화 된 라이브러리를 얻기 위해 필요할 것입니다. 특히, 컨쥬게이션 중 인큐베이션 시간은 B. gladioli의기하급수적 성장 단계의 끝인 12-18h를 초과할 수 없었다. 세균 세포의 기하급수적 성장 단계를 넘어 결합을 허용하면트랜스컨쥬펀트(26)를획득하는 성공 확률을 감소시킨다. 따라서, 균종의 성장에 따라 컨쥬게이션 기간을 조정해야 한다.
숙주에서 돌연변이 라이브러리의 감염을 성공적으로 수행하려면,감염1,2,27전에 라이브러리에 있는 식민지화 도중 세균성 인구 병목 현상 및 돌연변이의 다양성을 평가하는 것이 중요하다. 실험을 준비하기 위해 라이브러리의 각 돌연변이를 샘플링하고 식민지화할 수 있는 높은 기회를 갖기 위해 감염되어야 하는 딱정벌레의 최소 수를 추정했습니다. 생체 내 세균 발생 시간 및 실험 기간 동안세대 수에 대한 근사치도 계산하였다. 체외 문화는 인큐베이션 시간을 조정하여 비슷한 수의 세대까지 성장했습니다. 다른 비모델 호스트에서 유사한 감염 실험의 경우, 숙주 유기체의 실험실 배양 및 일정한 근원을 유지하는 능력이 바람직하다.
생체 내 및 시험관 내 및 샘플 수집에서 돌연변이 라이브러리의 성장에 따라, 트랜스포슨 삽입 시퀀싱을 위한 수정된 DNA 라이브러리 준비 프로토콜이 수행되었다. 프로토콜의 수정은 사용자 정의 PCR 프라이머를 설계하고 삽입 카세트를 포함하는 DNA 단편을 선택하는 PCR 단계를 추가하는 것을 포함했다. 프로토콜을 사용자 지정했기 때문에 프로토콜의 추가 PCR 주기는 최종 라이브러리에서 오버앰프 및 혼성 어댑터 조각의 위험을 증가시켰습니다. 따라서 이러한 조각을 제거하는 데 도움이 되므로 두 개의 PcR 후 최종 정리 단계(크기 선택 제외)가 권장됩니다. DNA 라이브러리의 크기 분포는 여전히 예상보다 광범위했습니다. 그러나 시퀀싱 깊이를 늘리면 생물정보학 분석 중에 필터링된 충분한 데이터가 제공되어 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.
트랜스포슨 매개 돌연변이 발생은 단일 실험에서 수천 개의 무작위 삽입을 생성하므로 세균 성장에 필수적인 유전자가 중단된 돌연변이를 제외한 모든 돌연변이체 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 우리는 버크 홀더리아 스프에 대한 다른 연구에서 필수 유전자의 추정을 감안할 때 포화 돌연변이 라이브러리와 함께 작동하지 않았을 가능성이 큽분입니다. 28,29. 그럼에도 불구하고 포화되지 않은 도서관은 표적 돌연변이 발생을 사용하여 추가 연구를 위한 다양한 후보 유전자를 탐구하는 데 도움이됩니다. 실험 전에, 일부 트랜스포슨에는게놈(30)의특정 좌엽에서 돌연변이의 풍부를 증가시키는 특정 삽입 표적 부위가 있다는 것을 기억하는 것도 중요하다. 마리너 트랜스포슨은삽입(31)에대한 AT 부위를 표적으로 하는 것으로 알려져 있으며, Tn5 트랜스포슨은 GC바이어스(32,33)를갖는다. 트랜스포슨 삽입에 대한 핫스팟을 인식하는 생물 정보학 분석 중에 단계를 포함하여 모든 분포 편향을 평가하는 데 도움이 됩니다.
좌절하는 경향이 있더라도, 잘 설계된 transposon 삽입 순서 분석 실험은 단 하나 실험 내의 박테리아에 있는 많은 조건부 로 중요한 유전자를 확인하는 강력한 공구일 수 있습니다. 예를 들어, 난초잎 괴사의 억제에 중요한 버크홀더리아 정액에 있는 12개의 유전자는 트랜스포손 돌연변이 발생 및 유전체학(34)을 결합하여 확인되었다. 버크홀더리아를 넘어, 여러 접착 및 운동 성 유전자와 수송은 아피스 멜라이프라 (허니비)22의 스노드 그라셀라 알비 공생에서 중요한 식민지 요인으로 확인되었으며, 유프리모 피셰리 공생 (하와이 밥테일 스퀴드)23 트랜스포지션을 사용하여 돌연변이 를 삽입하였다.
대체 접근법으로, 트랜스포슨 돌연변이 발생은 시퀀싱 대신 선택적 매체를 사용하여 개별 돌연변이에 대한 검열에 의해 뒤따를 수 있다. 운동성, 생리활성 이차 대사 산물 생산 또는 특정 보조 트로피와 같은 결함을 식별하기 위한 페노티픽 스크리닝 또는 생체 학적 검사가 가능합니다. 예를 들어, 버크홀더리아 곤충콜라(카바예로니아 35)의검진은 공생이 립토르투스 페데스트리,곤충숙주(36)를식민지화하기 위한 운동성 유전자를 채택한다는 것을 확인하는 데 핵심적인 것으로 나타났습니다. 더욱이, 트랜스포슨 돌연변이 발생 및 페노티픽 스크리닝을 이용하여, 생합성 유전자 클러스터는 생활성 이차 대사산물 카요이넨신(Burkholderia caryophylli37)에서확인되었다. 버크홀더리아 의사말레이의 보조 돌연변이는 트랜스포손 돌연변이 발생 및 검진에 따라 확인되었으며, 인간과 동물의 위험한 질병인 멜리오이도증에 대하여 가능한 감쇠 백신후보이다 38. 따라서, 트랜스포손 돌연변이 발생 및 시퀀싱은 병원성 또는 상호 연관에서 각각의 호스트와의 상호 작용에 중요한 박테리아의 분자 특성을 연구하는 데 있어 귀중한 접근법이다.
The authors have nothing to disclose.
이준범 교수님은 대장균 WM3064+pRL27 균주를 절차의 컨쥬게이션및 지도, 돌연변이 도서관 세대 의 문제 해결을 도운 카트린 허프마이어, 곤충 수집 및 허가 취득을 지원하는 안드레 로드리게스 교수에게 감사드립니다. 또한 레베카 얀케와 다그마르 클레브쉬에게 곤충의 수집과 사육을 지원해 주신 것에 대해서도 감사드립니다. 우리는 브라질 당국이 곤충 표본의 접근, 수집 및 수출에 대한 다음과 같은 허가를 부여한 것을 인정합니다: SISBIO 승인 Nr. 45742-1, 45742-7 및 45742-10, CNPq 공정 nº 01300.004320/2014-21 및 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR01615151DF 205.20.20.20.20.20.25.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.23. 이 연구는 독일 과학 재단 (DFG) 연구 보조금 FL1051/1-1 및 KA2846/6-1의 자금 지원을 받았습니다.
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |