Lagria villosa Böcekleri burkholderia gladioli Symbiont Bakteriyel Kolonizasyon Faktörlerini Elucidate için Bir Araç Olarak Transposon-ekleme Dizileme

1. Medya ve tampon hazırlama Tablo 1’deverilen KB ve LB ortam ve agar plakalarını hazırlayın ve 121 °C, 15 psi, 20 dk’da otoklavlayın. E.coli WM3064 + pRL27’yi kültlemeden önce otomatik kapatılmış LB ortamına 50 μg/mL filtre sterilize kanamycin ve 300 μM filtre sterilize edilmiş 2,6-diaminopimelik asit (DAP) ekleyin. Başarılı B. gladioli Lv-StA transkonjugantlarını seçmek için gerekli plakaları dökmek için otomatik kapatılmış KB agar’a 50 μg/mL filtre sterilize kanamycin ekleyin. Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 1x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na2HPO4 1.42 g/L ve KH2PO4 0.272 g/L. Tuzları damıtılmış suda çözün ve karışımı kullanımdan önce 121 °C, 15 psi, 20 dk’da otoklavlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Aşağıdaki bileşenleri çözerek 2x Bind ve yıkama tamponu hazırlayın: damıtılmış suda 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ve 2 M NaCl. Kullanmadan önce karışımı filtreleyin. Oda sıcaklığında saklayın. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 0.1 mM EDTA’yı çift damıtılmış suda eriterek 1x Düşük TE hazırlayın. 121 °C, 15 psi, 20 dk’da otoklavlayarak sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. 2. Transposon mutant kütüphanesini oluşturmak için konjugasyon Şekil 1: Konjugasyon protokolü adımları. Konjugasyon alıcısı Burkholderia gladioli Lv-StA (kırmızı) ve pRL27 plazmidini (pembe) içeren donör Escherichia coli, kanamycin ve DAP ile desteklenmiş sırasıyla KB agar ve LB’de yetiştirilir. Plazmidin 30 °C’de 12-18 saat konjugatif transferden sonra, transkonjugant B. gladioli hücreleri KANAMYCIN içeren KB’de seçilir ve bir araya getirilir. Kısaltmalar: DAP = 2,6-diaminopimelik asit; Kan = kanamycin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Steril bir davlumbaz altında, kanamycin ve DAP ile desteklenmiş 10 mL LB ortamda Escherichia coli WM3064 + pRL27’nin taze bir donör kültürünü aşıla. Burkholderia gladioli Lv-StA alıcı hücrelerini 5 mL KB ortamda aşıla. Kültürleri bir gecede 30 °C’de 250 rpm’de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Bir gecede büyümeden sonra, hücreleri peletmek için 6 dakika boyunca 9.600 × g’da kültürlerin her birinin 4 mL’sini santrifüj edin. Üstnatant atın. Steril bir davlumbaz altında, peletlenmiş hücre kültürlerini DAP içeren KB ortamında yıkayın ve son olarak kültürleri 4 mL KB + DAP ortamında ayrı ayrı yeniden diriltin. Taze bir 15 mL tüpte, yıkanmış E. coli donör hücrelerinin 250 μL’sini yıkanmış B. gladioli Lv-StA alıcı hücrelerinin 1 mL’si ile karıştırın. Bu konjugasyon hücresi karışımının 10 μL’yi DAP içeren KB agar plakalarında tespit edin. Plakanın steril kaputta 1 saat boyunca oda sıcaklığında bozulmadan dinlenmesine izin verin. Daha sonra, plakaları 30 °C’de 12-18 saat boyunca konjugasyon lekeleriyle kuluçkaya yatırın.NOT: Konjugasyon süresi hedef türlere göre ayarlanabilir. Bununla birlikte, uzun bir konjugasyon süresi, genoma çift ekleme veya plazmid entegrasyonu riskini arttırır. Yavaş büyüyen bakteriler için daha uzun konjugasyon sürelerine izin verin. Kuluçkadan sonra, steril bir kaputun altındaki plakalara 2-4 mL 1x PBS ekleyin ve büyüyen bakteriyel konjugasyon noktalarını agardan serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Konjuge hücre karışımını 2 mL mikrofuge tüplerine pipetlayın. Hücreleri 2 dakika boyunca 9.600 × g’da santrifüjleme yaparak pelet. Süpernatantı atın ve peleti yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 1 mL 1x PBS’de iki kez yıkayın. Son peleti 1200 μL 1x PBS’de yeniden sunun. Karışımdaki hücre sayısı 1 × 104’ünüzerindeyse kaplamadan önce seyreltmeler yapın. İyice karıştırın ve kanamycin ile desteklenmiş büyük KB agar plakaları (gerekirse 6 veya daha fazla) üzerine 200 μL hücre karışımını yayın ve gece boyunca 30 °C’de kuluçkaya yayın.NOT: Hedef mutant kolonileri seçici agar plakalarında 30 saat içinde görünür. Antibiyotik direnç belirteci nedeniyle, seçici agar plakasında sadece mutasyona uğramış koloniler görülür. Bu nedenle, tüm kolonilerin başarılı transkonjuganlar olması beklenir. Üç plaka üzerinde transkonjugant kolonilerinin toplam sayısını sayın ve tüm plakalarda elde edilen yaklaşık mutant sayısını hesaplamak için tahminde bulunma. Temsili bir kütüphane elde etme şansını artırmak için, toplam koloni sayısının genomdaki toplam gen sayısından birkaç kat daha fazla olduğundan emin olun. Konjugasyonun başarısını doğrulamak için, bölüm 3’te açıklandığı gibi 10-20 örnek koloni kullanarak ekleme kasetini hedefleyen bir PCR gerçekleştirin.NOT: Amaç, koloni sayısının tüm genomdaki gen sayısının en az 10 kat olmasını sağlamaktır, bu durumda 75.000 > mutanttır. Bununla birlikte, tam temsili bir kütüphaneye karşılık gelecek kolonilerin sayısını doğru bir şekilde tahmin etmek genellikle zordur. Mutasyona uğrayan benzersiz genlerin sayısı bu noktada belirgin değildir, temel genlerdeki bozulmaların yakalanmadığı göz önüne alındığında, aynı gen için genellikle birden fazla farklı mutasyon bölgesi vardır ve Tn5 transposonları ile oluşturulan mutasyonlar tamamen rastgele değildir. Steril bir davlumbazın altında, ağar üzerine 1-2 mL 1x PBS ekleyerek tabaklardan kolonileri kazıyın. Plakalardan kazınmış hücre karışımını 50 mL tüpler halinde bir araya alın. Kütüphaneyi iyice karıştırmak ve daha sonra havuza alınmış mutant kütüphanesinin 4 mL’lik kısmını birkaç kriyotüse bölmek için Vortex. Tüplere 1 mL% 70 gliserol ekleyin ve -80 ° C’de saklayın. 3. B. gladioli Lv-StA’da başarılı eklemeleri onaylamak için PCR ve jel elektroforezi Eklemenin varlığını onaylamak için, adım 2.9’daki seçim plakalarından tek tek mutant kolonileri seçin ve Tablo 2’delistelenen astarları kullanarak ekleme kasetini hedefleyen bir PCR gerçekleştirin. PCR ana karışımını Tablo 3’e göre hazırlayın ve Tablo 4’teaçıklandığı gibi termal çevrimde koşulları ayarlayın. Güçlendirilmiş DNA parçalarının beklenen 1580 bp uzunluğunda olup olmadığını kontrol etmek için PCR ürünlerini elektroforezi (250 V, 40 dk) ile% 1,6 agarose jel üzerinde çalıştırın. 4. Böcek yumurtalarında mutant havuz enfeksiyonu Kütüphane yıkama adımları Hazırlanan mutant kütüphanesinin bir aliquot’ını buzun üzerinde çözün. 2.683 × g’da 10 dakika santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Steril bir kaputun altında, kalan herhangi bir ortamı hücrelerden çıkarmak için hücreleri 4 mL 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri 1x PBS’nin 4 mL’sinde yeniden biriktirin. Bir hücre sayma odası kullanarak kitaplığın bir aliquot’undaki hücre sayısını sayın. Kütüphanenin bir bölümünü 1x PBS’de 2 ×10 6 hücre/μL’ye seyreltin. Gerekli ses seviyesini almadan önce tüm kütüphaneyi homojen bir şekilde karıştırmak için kütüphane aliquot’unu iyice vorteks edin. Yumurta debriyaj sterilizasyonu ve in vivo enfeksiyon Bir L. villosa yumurta debriyajı seçin. Yumurta sayısını sayın ve debriyaj 100’den fazla yumurta içeriyorsa devam edin. Tüm yumurta debriyajını sterilize edin. 200 μL% 70 etanol ekleyin ve yumurtaları 5 dakika boyunca hafifçe yıkayın. Etanolleri çıkarın ve yumurtaları iki kez otoklavlı suyla yıkayın. 200 μL% 12 çamaşır suyu (NaOCl) ekleyin ve yumurtaları 30 sn boyunca hafifçe yıkayın. Çamaşır suyunu hemen çıkarın ve yumurtaları 200 μL otomatik kapalı su ile üç kez tekrar yıkayın. Sterilize edilmiş yumurta debriyajında yıkanmış mutant kütüphanesinin 2 ×10 6 hücresini /μL’sini enfekte edin (yumurta başına 2,5 μL). Enfekte böcek larvaları yumurtadan çıktıktan iki gün sonra, 1,5 mL mikrofuge tüpü başına 100 2nd başlangıç larvaları toplayın ve -80 ° C’de depolayın. Tüp bebek mutant kütüphanesi kontrolü Steril bir davlumbaz altında, kanamycin içeren 10 mL KB ortamda yıkanmış mutant kütüphanesinin 2 × 106 hücre / μL’nin 250 μL’sini aşılayın. 30 °C’de in vitro mutant kültürünü 20 saat kuluçkaya yatırın.NOT: Koloniizasyon sırasında in vivo WT B. gladioli Lv-StA’nın yaklaşık nesil sayısıyla eşleşecek şekilde inkübasyon süresini hesaplayın. 20 saat inkübasyondan sonra, in vitro mutant kültürüne eşit miktarda% 70 gliserol ekleyin ve -80 ° C’de saklayın. 5. Enfekte böcekler ve in vitro mutant kütüphanesi DNA ekstraksiyonu NOT: DNA ekstraksiyonları, üreticinin aşağıda kısaca özetlenen protokolüne göre bir DNA ve RNA saflaştırma kiti kullanılarak gerçeklendirilmiştir. 1-2 mL sıvı azot ekleyerek ve bir pestle ile ezerek havuzlanmış larvaları (mikrofuge tüpü başına maksimum 4 mg) homojenize edin. Tüp bebekte yetişen mutant kültürlerini buzdaki gliserol stoklarından çözün. Hücre lizizden önce 10 dakika boyunca 9.600 × g’da santrifüj yaparak hücreleri pelet. In vitro ve in vivo örneklere 300 μL Doku ve Hücre liziz çözeltisi ekleyin. 5 μL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyin, karışımı 60 °C’de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 3-5 dakika boyunca buza yerleştirin. Lysates ve girdaplara iyice 150 μL protein çökeltme reaktifi ekleyin. 10 dakika boyunca 9.600 × g’da santrifüjleme yaparak protein kalıntılarını pelet. Süpernatantı 1,5 mL mikrobuj tüpüne aktarın. Süpernatanta 500 μL izopropanol ekleyin ve 1 saat veya bir gece boyunca -20 °C’de kuluçkaya yatırmadan önce tüpleri en az 40 kez hafifçe ters çevirin. 10 dakika boyunca 9.600 × g’da santrifüjleme yaparak çökemiş DNA’yı peletle. Süpernatant atın ve DNA peletine buz gibi% 70 etanol ekleyin. 5 dakika boyunca 10.000 ≥ × g’de santrifüj. Üstnatant atın ve numuneleri en az 1 saat boyunca hava kurumaya bırakın. 100 μL Low-TE tamponunda in vitro ve in vivo örneklerden ALıNAN DNA’yı yeniden dürt. Numuneleri -20 °C’de saklayın. 6. Kütüphane hazırlığının sıralanıyor NOT: DNA kütüphanesi hazırlama protokolü ve reaktifleri, DNA kütüphanesi hazırlama kitinin üreticisi tarafından sağlanan talimatlardan uyarlanır ve değiştirilir. Şekil 2: DNA kütüphanesi hazırlama adımlarının şeması. Kesme ve adaptör ligasyonundan sonra, değiştirilen protokol, ekleme kasetini içeren DNA parçalarını zenginleştirmek için bir streptavidin boncuk seçimi adımı içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Numuneleri 20 ng/μL konsantrasyona ve 100 μL hacme seyreltin ve buzda tutun. Ultrasonicator kullanarak in vivo ve in vitro örnek DNA’yı yamuma. Ultrasonicator’ı % 70 güçte ayarlayın. Örnekleri kısaca girdap ve 1 dakika 30 sn için makas.NOT: Ultrasonicator ayarları enstrümanlar arasında farklılık gösterecektir. Bu durumda, parça boyutu 200-400 bp idi, bu da 150 bp’lik bu sıralama yaklaşımı için uygundur, eşleştirilmiş uçlu (bkz. adım. 9.1). Kesme parametreleri deneycinin gereksinimlerine göre ayarlanabilir. DNA’nın istenen boyut aralığına yamup sildiği kontrol edin (bu durumda, 200-400 bp). 40 dakika boyunca 250 V’de çalışan% 1,6 agarose jel üzerinde 1:1 oranında jel yükleme boyası ile karıştırıldıktan sonra duyulmamış ve yamulmuş DNA’nın 5 μL’siniyükleyin (Şekil 3A,B). Adaptör ligasyonu için gereken parça uçlarının hazırlanması Yamüle DNA’nın 50 μL’sine, kütüphane hazırlama kitinde verilen uç hazırlama reaktiflerini ekleyin: enzim karışımının 3 μL’si ve 7 μL reaksiyon tamponu ve pipetleme ile iyice karıştırın. 75 °C’≥ ısıtmalı kapaklı bir termal çevrimleyici ayarlayın ve numuneleri 20 °C’de 30 dakika ve 65 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatırın. 4 °C’de tutun. Bağdaştırıcı ligasyonu Adaptör ligasyonu için, son hazırlık adımının ürünlerine aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer ve 2,5 μL seyreltilmiş Adaptör. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ısıtılan kapak kapalıyken termal çevrimde numuneyi 20 °C’de 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, enzimin 3 μL’sini ekleyin (urasil DNA glikosylaz + DNA glikosilaz-lyaz Endonucleaz VIII) (bkz. Malzeme Tablosu). Pipetleme ile iyice karıştırın ve numuneyi 37 °C’de 15 dakika boyunca kapağı 47 °C’de ısıtılmış bir termal çevrimde ≥.NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir ve numuneler -20 °C’de saklanabilir. 250 bp’lik adaptörle bağlı DNA hedefleme parçalarının boyut seçimi Manyetik boncuk çözeltisini vorteks edin (Malzeme Tablosunabakın) ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Liglenmiş DNA karışımının 96,5 μL’sine 0,3 kat boncuk ekleyin ve iyice pipetleyarak karıştırın. Boncuk karışımını 5 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Boncuk karışımında tuzların ve polietilen glikolün bulunması, BONCUKlar üzerinde DNA parçalarının çökeltilini kolaylaştırır. Boncukların DNA moleküllerine oranının düşük olması, sadece daha büyük DNA parçalarının boncuklara bağlanmasına yol açar. Bu durumda, 250 bp’nin üzerindeki DNA parçaları boncuklara bağlanır. Boncukları aşağı çekmek ve istenmeyen boyuttaki DNA parçalarını çıkarmak için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Boncukların 5 dakika yerleşmesine izin verin ve ardından açık süpernatantı yeni bir mikrofuge tüpüne aktarın (süpernatantı saklayın). Süpernatant içine 0,15x taze boncuk ekleyin ve iyice pipetleme yaparak karıştırın. Boncuk karışımını 5 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hedef DNA’ya bağlı boncukları aşağı çekmek için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. 5 dakika bekleyin ve ardından süpernatant atın (boncukları saklayın).NOT: Boncukların DNA’ya olan bu oranı, istenen 250 bp büyüklüğündeki parçaların bağlanmasına yol açar. Manyetik standdaki boncuklarla, % 80 etanol 200 μL ekleyin (taze hazırlanmış) ve 30 s bekleyin. Pipet dışarı ve manyetik standdaki boncukları rahatsız etmeden etanol yıkama dikkatlice atın. Bu adımı yineleyin. Son yıkamadan sonra, boncuklardan etanol izlerini çıkarın ve daha sonra boncukları parlak görünene kadar 2 dakika boyunca havayla kurulayın, ancak tamamen kurumadılar. Boncukları fazla kurutmayın. Tüpleri manyetik standdan çıkarın ve 10 mM Tris-HCl veya 0,1x TE (Düşük TE) 17 μL ekleyin. ~10 kez pipetleme ile karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri manyetik standa geri yerleştirin ve 5 dakika bekleyin. Boncuklar yerleştikten sonra DNA’nın üstünü yeni bir tüpe aktarın. PCR I, ekleme kasetini içeren DNA parçalarına biotin etiketi eklemek için Transposon spesifik biyotinilasyonlu astarı (Tablo 5) ve bir indeks astarı kullanarak Tn5 ekleme kasetini içeren DNA parçalarına biyotinillenmiş astar etiketi ekleyin. PCR ana karışımını Tablo 6’ya göre hazırlayın ve Tablo 7’delistelenen termal çevrimleyici için PCR koşullarını izleyin. Boyut seçimi olmadan PCR I’in temizlenmesi Vortex 0.9x boncukları temizleyip temizlemeden önce en az 30 dakika oda sıcaklığına yerleştirin. PCR ürünlerine 0,9x boncuk ekleyin ve iyice karıştırın. Boncukları aşağı çekmek için boncukları manyetik bir standa yerleştirin. Şeffaf süpernatant çıkarın ve boncuk bağlı DNA’yı 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın. Yıkama adımlarından sonra etanolleri çıkarın ve boncukları parlak görünene kadar kurutun, ancak çok kurumasın. 32 μL 10 mM Tris-HCl veya 0,1X TE (Düşük TE) ekleyin ve boncukları 5 dakika kuluçkaya yatırın. Karışımı manyetik standa geri yerleştirin ve süpernatantı taze bir mikroyakıt tüpüne aktarın. Biyotinillenmiş DNA parçalarını streptavidin boncuklarına bağlama 1x Bind ve-wash tamponunda 32 μL streptavidin boncuklarını yeniden depola. Manyetik bir standa yerleştirilirken boncukları tamponla üç kez yıkayın. 32 μL 2x Bağla ve yıka tamponu ekleyin ve boncukları yeniden depoleyin. Buna, temizlenmiş PCR 1 ürünlerinin 32 μL’sini ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırarak. Boncuk-DNA karışımını 2 dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Pipet, takma kenarını içeren biotin etiketli DNA olarak süpernatantı boncuklardaki streptavidin’e bağlar. Boncukları 500 μL 1x Bağla ve yıka tamponu ile yıkayın ve ardından boncukları 200 μL Düşük TE ile yıkayın. DNA’ya bağlı boncukları 17 μL Düşük TE’de yeniden dirilt. Ekleme kaseti kenarını içeren parçalara bağdaştırıcı eklemek için PCR II Tablo 8’degösterildiği gibi, Tablo 5 ‘te listelenen dizin astarlarını ve değiştirilmiş evrensel PCR astarlarını kullanarak bir ana karışım hazırlayın. PCR karışımına önceki adımdan 15 μL DNA’ya bağlı streptavidin boncuk ekleyin. Termal çevrimleyici koşulları için Tablo 7’ye bakın. Bu protokolün 6.8. Son DNA ürünlerini 30 μL moleküler dereceli suda kurut. Numuneleri -20 °C’de saklayın ve sıralama için kullanın. 7. Sıralama ve analiz Yüksek aktarım hızı sıralama teknolojisini kullanarak kitaplığı sıralayın. Aşağıda belirtildiği gibi, transposon kitaplığı boyutuna bağlı olarak sıralama derinliğini ayarlayın. FastQC7ile okuma kalitesini değerlendirin. Okumanın 5′ ucundaki Tn5 ekleme kenarını içeren okumaları seçin ve Cutadapt8 ve/veya Trimmomatic9kullanarak ekleme kenarı sırasını kaldırın.NOT: Burada, okuma başına 150 bp hedeflemek için eşleştirilmiş uçlu bir sıralama yaklaşımı kullanıldı ve toplam 8 Mio okuma. Temsili bir veri kümesi elde etmek için, toplam sıralı okuma sayısının kitaplıktaki mümkün olan en fazla mutant sayısını, yani 2.9 adımındaki toplam tahmini koloni sayısını aştığından emin olun. Referans olarak, bu protokol mümkün olan en büyük kütüphane boyutunun 40 katını amaçlaydı. Benzer bir amaç için Tn-seq kullanan diğer başarılı çalışmalar, ilgili mutant kütüphanesindeki gerçek benzersiz ekleme sayısının 25 katına yakın toplam okuma sayısınısıraladı 22,23. Genlerin uçlarındaki mutasyonların işlevsel olarak bozucu olmadığını göz önünde bulundurarak, referans genom GFF dosyasının gen ek açıklamalarının her iki ucundan% 5 indirim. Bowtie2 10 kullanarak kırpılan okumaları referans genomunaeşleyin. Bam hizalama dosyasındaki benzersiz 5’ konum sayısından ekleme sayısını hesaplayın. FeatureCounts11kullanarak, her çoğaltma örneği için isabet genlerinin sayısını elde edin. RStudio’daki DESeq212 paketini kullanarak, farklı koşullar arasındaki mutant bolluklarındaki farkı hesaplayın.