ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

1. メディアおよびバッファの準備 表1に示すようにKBおよびLB培地と寒天プレートを準備し、オートクレーブを121°C、15 psi、20分で用意します。 50 μg/mL フィルター滅菌カナマイシンと 300 μM フィルター滅菌 2,6-ジアミノピム酸 (DAP) をオートクレーブ LB 培地に加えてから、 大腸菌 WM3064 + pRL27 を培養します。 50 μg/mL フィルター滅菌カナマイシンをオートクレーブされたKB寒天に加え、成功した B.グラディオリ Lv-StAトランスコンジュガントの選択に必要なプレートを注ぎます。 以下の成分を混合して1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製する:NaCl 8 g/L、KCl 0.201 g/L、Na2HPO4 1.42 g/L、KH2 PO4 0.272 g/L.蒸留水に塩を溶解し、混合物を121°C、15 psi、20 minでオートクレーブします。室温で保管してください。 2x の結合洗浄バッファーを次のコンポーネントを溶解して準備します: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)、および蒸留水に 2 M NaCl.使用前に混合物をフィルター殺菌する。室温で保管してください。 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) と 0.1 mM EDTA を二重蒸留水に溶解して、1x Low-TE を調製します。121°C、15 psi、20分でオートクレーブすることにより滅菌します。室温で保管してください。 2. トランスポゾン変異ライブラリを生成するコンジュゲーション 図1: 活用プロトコルの手順 共役の バークホルデリア・グラディオリ ・Lv-StA(赤)とpRL27プラスミド(ピンク)を含むドナー のエシェリヒア・コリ は、それぞれKB寒天およびLBで栽培され、カナマイシンおよびDAPを補う。プラスミドを30°Cで12〜18時間結合した後、トランスコンジュガント B.グラディオリ 細胞をカナマイシンを含むKB上で選択し、一緒にプールする。略語: DAP = 2,6-ジアミノピム酸;カン=カナマイシン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 無菌フードの下で、カナマイシンおよびDAPを添加したLB培地の10mLで 、大腸菌 WM3064+pRL27の新鮮なドナー培養を接種する。5 mLのKB培地で バークホルデリア・グラディオリ Lv-StA レシピエント細胞を接種する。250 rpmでシェーカーで一晩30°Cで培養をインキュベートします。 一晩増殖した後、各 ×培養 物の4mLを6分間6分間培養した遠心分離機を6分間ペレットする。上清を捨てます。 無菌フードの下で、ペレット化された細胞培養物をDAPを含むKB培地で洗浄し、最後に4mLのKB+DAP培地で別々に再懸濁した。 新鮮な15 mLチューブに、洗浄された 大腸菌 ドナー細胞の250 μLを、洗浄 されたB.グラディオリ Lv-StAレシピエント細胞の1 mLと混合します。 DAPを含むKB寒天プレート上のこの共役細胞混合物のスポット10 μL。プレートを室温で1時間放置します。次に、30°Cのコンジュゲーションスポットでプレートを12〜18時間インキュベートする。注:結合期間は、ターゲット種に応じて調整することができます。しかし、長い結合期間は、ゲノムへの二重挿入またはプラスミドの統合のリスクを高める。増殖が遅い細菌の場合、より長い共役期間を可能にする。 インキュベーション後、滅菌フードの下のプレートに2〜4mLのPBSを加え、細胞スクレーパーを使用して、成長した細菌結合スポットを寒天から放出します。コンジュゲートセルミックスを2 mLマイクロフュージチューブにピペットします。 ペレット細胞は、9,600×gで2分間遠心分離して細胞をペレット化した。上清を捨て、1xPBSの1mLでペレットを上下にピペットで2回洗います。最終ペレットを1x PBSの1200 μLで再懸濁します。混合物中の細胞数が1×104を超える場合は、めっき前に希釈を行う。 大きなKB寒天プレート(必要に応じて6個以上)に200μLの細胞混合物をよく混ぜて広げ、カナマイシンを補充し、一晩で30°Cでインキュベートします。注:標的変異コロニーは、選択的寒天プレート上で30時間以内に現れる。抗生物質耐性マーカーのために、変異したコロニーのみが選択的寒天プレートに現れる。したがって、すべてのコロニーは、トランスコンジュガントが成功することが期待されます。 3つのプレート上のトランスコンジュガントコロニーの総数を数え、全てのプレートで得られた変異体の概数を計算するために推定する。代表的なライブラリーを得る可能性を高めるには、コロニーの総数がゲノム内の遺伝子の総数よりも数倍高いことを確認してください。結合の成功を確認するために、セクション3に記載されているように、10〜20個のサンプルコロニーを用いて挿入カセットを標的とするPCRを行う。注:目的は、コロニーの数がゲノム全体(この場合は75,000変異体 >)の遺伝子の数の少なくとも10倍であることを保証することです。しかし、完全に代表的な図書館に対応するコロニーの数を正確に推定することは一般的に困難です。変異したユニークな遺伝子の数は、本質的な遺伝子の破壊が捕捉されないことを考えると、同じ遺伝子に対して複数の異なる突然変異部位が存在することが多く、Tn5トランスポゾンで生成される突然変異は完全にランダムではないことを考えると、現時点では明らかではありません。 無菌フードの下で、寒天に1-2 mLの1x PBSを加えることによってプレートからコロニーを削ります。プレートから削り取った細胞混合物を50 mLチューブにプールします。ライブラリを完全に混合し、プールされた変異型ライブラリの4 mLをいくつかのクライオチューブに分割するボルテックス。70%のグリセロールを1mL加え、-80°Cで保存します。 3. B. グラディオリLv-StA での挿入成功を確認する PCR とゲル電気泳動 挿入の有無を確認するために、ステップ2.9の選択プレートから個々の変異コロニーを選び、 表2に記載されたプライマーを用いて挿入カセットを標的とするPCRを行う。 表3 に従ってPCRマスターミックスを準備し、サーマルサイクラーに条件を設定します( 表4に記載)。 PCR産物を電気泳動(250 V、40分)で1.6%アガロースゲルで実行し、増幅されたDNA断片が予想される長さ1580bpであるかどうかを確認します。 4. カブトムシ卵の変異プール感染 ライブラリの洗浄手順 氷上で調製された変異体ライブラリーのアリコートを解凍する。2,683×gで10分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。無菌フードの下で、細胞から残りの培地を取り除くために、4 mLの1x PBSで細胞を洗浄します。細胞を1x PBSの4 mLで再懸濁する。 細胞計数チャンバーを使用して、ライブラリのアリコート内のセル数をカウントします。ライブラリの一部を1x PBSで2×10個の6 セル/μLに希釈します。 必要なボリュームを取る前にライブラリ全体を均一に混合するためにライブラリアリコートを完全に渦巻く。 卵クラッチ滅菌と 生体内 感染 L.ビロサエッグクラッチを選択します。卵の数を数え、クラッチに100個以上の卵が含まれている場合は続行します。 卵クラッチ全体を殺菌します。 200 μLの70%エタノールを加え、卵を5分間静かに洗います。エタノールを取り出し、卵をオートクレーブ水で2回洗います。 200 μLの 12%漂白剤(NaOCl)を加え、卵を30秒軽く洗います。すぐに漂白剤を取り出し、200μLのオートクレーブ水で卵を再び3回洗います。 滅菌された卵クラッチ(卵1個あたり2.5μL)で洗浄された変異体ライブラリの2×10 6細胞/μLに感染します。 感染したカブトムシの幼虫の孵化の2日後、1.5 mLマイクロフュージチューブあたり1002nd インスター幼虫を集め、-80°Cで保管します。 インビトロ 変異体ライブラリー制御 無菌フードの下で、20×の250μLを10個の6 細胞/μLの洗浄された変異体ライブラリーの10mLのKM培地にカナマイシンを含む。 インビトロ変異培養を30°Cで20時間インキュベートする。注:植え込み中にインキュベーションの持続時間を計算し、VIVOでWT B.グラディオリLv-StAの世代のおおよその数に一致させます。 20時間インキュベーション後、 インビトロ 変異培養液に70%グリセロールの等量を加え、-80°Cで保存する。 5. 感染したカブトムシと インビトロ 変異体ライブラリーDNA抽出 注:DNA抽出は、下記のメーカーのプロトコルに従ってDNAおよびRNA精製キットを使用して行われました。 1-2 mLの液体窒素を加え、害虫で粉砕することにより、プールされた幼虫(マイクロフュージチューブあたり最大4mg)を均質化します。 氷上のグリセロールストックからインビトロ成長変異培養物を解凍します。細胞リシスの前に9,600×gで遠心分離して10分間ペレットをペレット化した。 イン ビトロ および インビボ サンプルに300 μLの組織および細胞溶解溶液を加えます。10 mg/mL プロテイナーゼ K 5 μL を加え、60 °C で 15 分間インキュベートし、氷の上に 3~5 分間置きます。 150 μLのタンパク質沈殿試薬を、ライゼトと渦に十分に加えます。9,600×gで遠心分離して10分間、タンパク質デブリをペレットにする。 上清を1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。上清にイソプロパノールの500 μLを加え、1時間または一晩-20°Cでインキュベートする前に、チューブを少なくとも40回穏やかに反転させます。 9,600×gで遠心分離により沈殿したDNAを10分間ペレットにした。上清を捨て、氷冷70%エタノールをDNAペレットに加えます。 5分間≥10,000×gで遠心分離機。上清を捨て、サンプルを少なくとも1時間空気乾燥させたままにしておきます。 100 μLの低TEバッファーで インビトロ および インビボ サンプルからDNAを再懸濁します。 サンプルは-20°Cで保管してください。 6. シーケンシングライブラリの準備 注:DNAライブラリ調製用のプロトコルおよび試薬は、DNAライブラリ調製キットの製造業者が提供する指示に基いて適合および改変されます。 図2:DNAライブラリー調製工程の概略図 剪断およびアダプターのライゲーションの後、修飾されたプロトコルは、挿入カセットを含むDNA断片を濃縮するストレプトアビジンビーズ選択ステップを含む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 サンプルを20 ng/μL濃度、体積100μLに希釈し、氷の上に保管します。 超音波処理器を用いた 生体内 および インビトロ サンプルDNAの剪断。超音波装置を70%の電力に設定します。サンプルを短時間で渦を出し、1分30分間剪断する。注:超音波装置の設定は、機器によって異なります。この場合、フラグメントサイズは200〜400bpであり、これは150 bpのこのシーケンシングアプローチ、ペアエンド(ステップ9.1を参照)に適している。せん断パラメータは、実験者の要件に応じて調整できます。 DNAが所望のサイズ範囲(この場合は200-400 bp)までシア化されているかどうかを確認してください。250 Vで40分間、1.6%のアガロースゲルで1:1の比率でゲルローディング色素と混合した後、未シェレおよびシアドDNAの5μLをロードする(図3A、B)。 アダプターの結紮に必要なフラグメント末端の調製 50 μL のせん綿 DNA に、ライブラリー調製キットに記載されているエンド調製用試薬を追加します: 酵素ミックスの 3 μL と反応バッファー 7 μL とピペットによる混合をよく行います。75°C ≥で加熱蓋をしたサーマルサイクラーをセットし、20°Cで30分間、65°Cで30分間インキュベートします。 4 °Cで保持します。 アダプターライゲーション アダプターライゲーションの場合、エンド調製工程の製品に次の試薬を追加します: 30 μL ライゲーションマスターミックス、1 μL ライゲーションエンハンサー、および 2.5 μL 希釈アダプター。ピペットで十分に混合し、加熱された蓋をオフにしてサーマルサイクラーで20°Cで15分間インキュベートします。 15分後、酵素(ウラシルDNAグリコシラーゼ+DNAグリコシラーゼ-エンドヌクレアーゼVIII)を3μL添加する( 材料表参照)。ピペットでよく混ぜ、37°Cで15分間、蓋を≥47°Cで加熱したサーマルサイクラーでインキュベートします。メモ:この手順ではプロトコルを一時停止することができ、サンプルは-20°Cで保存できます。 250 bpのアダプター連結DNA標的フラグメントのサイズ選択 磁気ビーズ溶液をボルテックスし( 材料表を参照)、室温で30分間使用します。 0.3倍のビーズを合体したDNA混合物の96.5 μLに加え、十分にピペットで混ぜます。ビーズ混合物を5分間インキュベートします。注:ビーズ混合物中の塩およびポリエチレングリコールの存在は、ビーズ上のDNA断片の沈殿を容易にする。DNA分子に対するビーズの比率が低いと、より大きなDNA断片とビーズへの結合のみが可能になります。この場合、長さが250bpを超えるDNA断片はビーズに結合する。 チューブを磁気スタンドに置いてビーズを引き下げ、不要なサイズのDNA断片を取り除きます。ビーズを5分間落ち着かせ、透明な上清を新しいマイクロフュージチューブに移します(上清を保ちます)。 上清に0.15倍の新鮮なビーズを加え、よくピペットで混ぜます。ビード混合物を5分間インキュベートし、チューブを磁気スタンドに置き、標的DNAに結合したビーズを引き下げます。5分間待ってから上清を捨てます(ビーズを保管してください)。注:DNAに対するビーズのこの比率は、所望の250 bpサイズの断片の結合につながります。 磁気スタンドにビーズを付けて、200 μLの80%エタノール(作りたての)を加え、30秒待ちます。ピペットアウトし、磁気スタンドのビーズを邪魔することなく、慎重にエタノール洗浄を廃棄します。この手順を繰り返します。 最後の洗浄後、ビーズからエタノールの痕跡を取り除き、光沢があるように見えるが完全に乾燥しないまで2分間ビーズを空気乾燥させます。ビーズを過度に乾燥させないでください。 磁気スタンドからチューブを取り外し、10 mM Tris-HClまたは0.1x TE(ローテア)の17 μLを追加します。~10回ピペットで混ぜ、室温で2分間インキュベートします。 チューブを磁気スタンドに戻し、5分間待ちます。ビーズが落ち着いたら、DNA上清を新しいチューブに移します。 PCR I は、挿入カセットを含む DNA フラグメントにビオチン タグを追加します。 トランスポゾン特異的ビオチン化プライマー(表5)とインデックスプライマーを使用して、Tn5挿入カセットを含むDNA断片にビオチン化プライマータグを追加します。 表 6 に従って PCR マスター ミックスを準備し、 表 7に示すサーマル サイクラーの PCR 条件に従ってください。 サイズ選択なし PCR I のクリーンアップ 渦0.9xビーズを室温で30分以上置いてからクリーンアップします。 PCR製品に0.9xビーズを加え、十分に混ぜます。 ビーズを磁気スタンドに置き、ビーズを引き下げます。 透明な上清を取り除き、作りたての80%エタノールを2回2回200μLでビーズ結合DNAを洗います。 洗浄段階の後にエタノールを取り出し、光沢があるように見えるが乾燥しすぎないまでビーズを空気乾燥させます。 32 μLの 10 mM Tris-HCl または 0.1X TE (Low-TE) を加え、5 分間インキュベートします。マグネットスタンドに戻って混合物を置き、上清を新鮮なミクロフュージチューブに移します。 ビオチン化されたDNA断片をストレプトアビジンビーズに結合する ストレプトアビジンビーズの32 μLを1xのバインド・アンド・ウォッシュバッファーに再懸濁します。磁気スタンドに置いた状態で、ビーズをバッファーで3回洗います。 2x バインド アンド ウォッシュ バッファの 32 μL を追加し、ビーズを再中断します。これに、クリーンアップ PCR 1 製品の 32 μL を追加します。完全に混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。 ビーズとDNAの混合物を磁気スタンドに2分間置きます。ピペットは、挿入エッジを含むビオチンタグ付きDNAとして上清を出し、ビーズ上のストレプトアビジンに結合する。 500 μLの 1x バインド アンド ウォッシュ バッファでビーズを洗浄し、200 μL の Low-TE でビーズを洗います。DNA結合ビーズを17μLの低TEで再懸濁します。 挿入カセットエッジを含むフラグメントにアダプターを追加するPCR II 表 8に示すように、表5に示すインデックスプライマーおよび修飾ユニバーサル PCR プライマーを使用してマスター ミックスを準備します。前のステップから15μLのDNA結合ストレプトアビジンビーズをPCRミックスに添加します。サーマルサイクラーの状態については、表7を参照してください。 このプロトコルのステップ6.8で示されているように、サイズを選択せずにPCR製品をクリーンアップします。最終的なDNA製品を分子グレードの水の30 μLで溶出します。 サンプルを-20°Cに保存し、シーケンシングに使用してください。 7. シーケンシングと分析 ハイスループットシーケンス技術を使用してライブラリをシーケンスします。以下に示すように、トランスポゾン ライブラリのサイズに応じてシーケンスの深さを調整します。FastQC7で読み取り品質を評価します。読み取りの 5′ の終わりに Tn5 挿入エッジを含む読み取りを選択し、Cutadapt8 および/または Trimmomatic9を使用して挿入エッジシーケンスを削除します。注: ここでは、ペアエンドのシーケンシングアプローチを使用して、読み取りあたり 150 bp をターゲットにし、合計で 8 Mio 読み取りが行われます。代表的なデータセットを取得するには、シーケンス読み取りの総数がライブラリ内の突然変異体の最大数(すなわち、ステップ2.9からのコロニーの合計推定数)を超えることを確認する。参考として、このプロトコルは、可能な最大ライブラリサイズの40倍を目指しました。同様の目的のためにTn-seqを用いた他の成功した研究は、対応する変異ライブラリー22,23における実際のユニーク挿入数の25倍近くの読み取りの総数を配列した。 遺伝子の末端の突然変異が機能的に破壊的ではないことを考慮して、参照ゲノムGFFファイルの遺伝子注釈の両端から5%をトリミングする。Bowtie210を使用して、トリミングされた読み取りを参照ゲノムにマッピングします。 配置 BAM ファイル内の一意の 5′ 位置の数から挿入の数を計算します。 FeatureCounts11を使用して、各反復サンプルのヒット遺伝子の数を取得します。 RStudio の DESeq212 パッケージを使用して、異なる条件間の変異量の差を計算します。