Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell’afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l’imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .
Prima della degenerazione neuronale, la causa dei deficit motori e cognitivi nei pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e /o demenza del lobo frontotemporale (FTLD) è la disfunzione della comunicazione tra neuroni e motoneuroni e muscoli. Il processo sottostante della trasmissione sinaptica coinvolge la fusione delle vescicole sinaptiche dipendenti dalla depolarizzazione della membrana e il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi. Questo processo avviene attraverso l’afflusso localizzato di calcio nei terminali presinaptici dove risiedono le vescicole sinaptiche. Qui, il protocollo descrive metodologie di live-imaging basate sulla fluorescenza che riportano in modo affidabile l’esocitosi delle vescicole sinaptiche mediate dalla depolarizzazione e le dinamiche di afflusso terminale di calcio presinaptico nei neuroni in coltura.
Utilizzando un colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche, viene chiarito il rilascio di vescicole sinaptiche. D’altra parte, per studiare l’ingresso del calcio, viene utilizzato Gcamp6m, un reporter fluorescente geneticamente codificato. Impieghiamo una depolarizzazione ad alto contenuto mediata da cloruro di potassio per imitare l’attività neuronale. Per quantificare l’esocitosi delle vescicole sinaptiche in modo inequivocabile, misuriamo la perdita di fluorescenza normalizzata del colorante stirilico in funzione del tempo. In condizioni di stimolazione simili, in caso di afflusso di calcio, aumenta la fluorescenza di Gcamp6m. La normalizzazione e la quantificazione di questo cambiamento di fluorescenza vengono eseguite in modo simile al protocollo del colorante stirilico. Questi metodi possono essere multiplexati con sovraespressione basata sulla trasfezione di proteine mutanti marcate fluorescentemente. Questi protocolli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la disfunzione sinaptica in modelli di FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizzando i neuroni corticali e motori dei roditori primari. Questi protocolli consentono facilmente uno screening rapido di composti che possono migliorare la comunicazione neuronale. In quanto tali, questi metodi sono preziosi non solo per lo studio della SLA, ma per tutte le aree della ricerca neurodegenerativa e delle neuroscienze dello sviluppo.
La modellazione della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in laboratorio è resa particolarmente impegnativa a causa della natura estremamente sporadica di oltre l’80% dei casi1, insieme al vasto numero di mutazioni genetiche note per essere causative della malattia2. Nonostante ciò, tutti i casi di SLA condividono la caratteristica unificante che prima della degenerazione neuronale vera e propria, esiste una comunicazione disfunzionale tra motoneuroni presinaptici e cellule muscolari postsinaptiche3,4. Clinicamente, poiché i pazienti perdono la connettività dei restanti motoneuroni superiori e inferiori, presentano caratteristiche di iper- e ipoeccitabilità neuronale in tutta la malattia5,6,7,8,9, riflettendo complessi cambiamenti molecolari sottostanti a queste sinapsi, che noi, come ricercatori della SLA, cerchiamo di capire.
Molteplici modelli transgenici hanno dimostrato che il deterioramento e la disorganizzazione della giunzione neuromuscolare si verificano con l’espressione di mutazioni genetiche causative della SLA, tra cui SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 attraverso valutazioni morfologiche, compresa la valutazione dei bouton sinaptici, delle densità della colonna vertebrale e dell’organizzazione pre/postsinaptica. Meccanicamente, a partire dai documenti di riferimento di Cole, Hodgkin e Huxley nel 1930, è stato anche possibile valutare le risposte sinaptiche attraverso tecniche elettrofisiologiche in colture cellulari in vitro o preparazioni di fette di tessuto20. Attraverso queste strategie, molti modelli di SLA hanno dimostrato deficit di trasmissione sinaptica. Ad esempio, una variante mutante di TDP43 provoca una maggiore frequenza di attivazione e diminuisce la soglia del potenziale d’azione nelle cellule simili a motoneuroni NSC-34 (midollo spinale x neuroblastoma ibrido linea 34)21. Questa stessa variante causa anche la trasmissione sinaptica disfunzionale alla giunzione neuromuscolare (NMJ) prima dell’insorgenza di deficit motori comportamentali in un modello murino22. In precedenza è stato dimostrato che l’espressione di FUS mutante provoca una ridotta trasmissione sinaptica all’NMJ in un modello di drosophila di FUS-ALS prima dei difetti locomotori11. Un recente rapporto che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte derivate da portatori di espansione C9orf72 ha rivelato una riduzione del pool prontamente rilasciabile di vescicole sinaptiche23. Complessivamente, questi studi e altri evidenziano l’importanza di costruire una comprensione più completa dei meccanismi alla base della segnalazione sinaptica nei modelli rilevanti per la malattia della SLA. Questo sarà fondamentale per comprendere la patobiologia della SLA e sviluppare potenziali bersagli terapeutici per i pazienti.
I metodi delle celle di serraggio di corrente e tensione sono stati preziosi nel determinare le proprietà della membrana come la conduttanza, il potenziale di membrana a riposo e il contenuto quantico delle singole sinapsi20,24. Tuttavia, uno dei limiti significativi dell’elettrofisiologia è che è tecnicamente impegnativo e fornisce solo approfondimenti da un singolo neurone alla volta. La microscopia confocale a cellule vive, accoppiata con specifiche sonde fluorescenti, offre l’opportunità di indagare la trasmissione sinaptica dei neuroni in modo spaziotemporale25,26,27. Sebbene non sia una misura diretta dell’eccitabilità neuronale, questo approccio di fluorescenza può fornire una misura relativa di due correlazioni molecolari della funzione sinaptica: rilascio di vescicole sinaptiche e transienti di calcio ai terminali sinaptici.
Quando un potenziale d’azione raggiunge la regione terminale presinaptica dei neuroni, si innescano transitori di calcio, facilitando la transizione da un segnale elettrico al processo di rilascio di neurotrasmettitori28. I canali del calcio voltaggio-dipendenti localizzati in queste aree regolano strettamente la segnalazione del calcio per modulare la cinetica del rilascio dei neurotrasmettitori29. Le prime registrazioni riportate a fluorescenza di transienti di calcio sono state eseguite utilizzando l’indicatore a doppia lunghezza d’onda Fura-2 AM o il colorante a singola lunghezza d’onda Fluo-3 AM30,31,32. Mentre questi coloranti offrivano grandi nuove intuizioni all’epoca, soffrono di diverse limitazioni come la compartimentazione non specifica all’interno delle cellule, la perdita di colorante attiva o passiva dalle cellule etichettate, il fotosbiancamento e la tossicità se ripresi per lunghi periodi di tempo33. Negli ultimi dieci anni, gli indicatori di calcio geneticamente codificati sono diventati i cavalli di battaglia per l’imaging di varie forme di attività neuronale. Questi indicatori combinano una proteina fluorescente modificata con una proteina chelante di calcio che cambia rapidamente l’intensità di fluorescenza dopo il legame degli ioni Ca2+34. L’applicazione di questi nuovi indicatori è vasta, consentendo una visualizzazione molto più semplice dei transitori intracellulari di calcio sia in vitro che in vivo. Una famiglia di questi reporter geneticamente codificati, nota come GCaMP, è ora ampiamente utilizzata. Questi indicatori contengono un dominio calmodulina C-terminale, seguito da una proteina fluorescente verde (GFP), e sono coperti da una regione di legame con la calmodulina N-terminale35,36. Il legame del calcio al dominio calmodulina innesca un’interazione con la regione di legame con la calmodulina, con conseguente cambiamento conformazionale nella struttura complessiva della proteina e un sostanziale aumento della fluorescenza della porzione GFP35,36. Nel corso degli anni, questa famiglia di reporter ha subito diverse evoluzioni per consentire letture distinte per particolari transienti di calcio con cinetica specifica (lenta, media e veloce), ognuno con proprietà leggermente diverse37,38. Qui, è stato evidenziato l’uso del reporter GcaMP6, che ha precedentemente dimostrato di rilevare potenziali d’azione singoli e transitori di calcio dendritico nei neuroni sia in vivo che in vitro37.
I transienti di calcio nella regione presinaptica innescano eventi di fusione delle vescicole sinaptiche, causando il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi e l’inizio di eventi di segnalazione nella cellula postsinaptica28,39. Le vescicole sinaptiche vengono rilasciate rapidamente e riciclate, poiché la cellula mantiene omeostaticamente una superficie di membrana cellulare stabile e un pool prontamente rilasciabile di vescicole legate alla membrana in grado di fusione40. Il colorante stirilico qui utilizzato ha un’affinità verso le membrane lipidiche e cambia specificamente le sue proprietà di emissione in base all’ordinamento dell’ambiente lipidico circostante41,42. Pertanto, è uno strumento ideale per etichettare le vescicole sinaptiche di riciclaggio e il successivo tracciamento di queste vescicole in seguito alla stimolazione neuronale41,42. Il protocollo che è stato generato e ottimizzato è un adattamento dei concetti descritti inizialmente da Gaffield e colleghi, che ci consente di visualizzare continuamente la puntura di vescicole sinaptiche marcate con colorante stirilico nel tempo41.
Qui vengono descritte due metodologie correlate basate sulla fluorescenza, che riportano in modo affidabile eventi cellulari specifici coinvolti nella trasmissione sinaptica. Sono stati definiti protocolli per sondare la dinamica dell’afflusso terminale di calcio presinaptico mediato dalla depolarizzazione e dell’esocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni in coltura. Qui, i metodi e i risultati rappresentativi si concentrano sull’uso di neuroni corticali o motoneuroni primari dei roditori come sistema modello in vitro, poiché ci sono studi pubblicati che utilizzano questi tipi di cellule43,44. Tuttavia, questi metodi sono applicabili anche ai neuroni corticali i3 umani differenziati45, poiché abbiamo anche avuto successo con entrambi i protocolli nella sperimentazione attualmente in corso nel nostro laboratorio. Il protocollo generale è delineato in un formato lineare graduale, mostrato nella Figura 1. In breve, per studiare la dinamica del calcio nei neuriti, i neuroni maturi vengono trasfettati con DNA plasmidico per esprimere il reporter fluorescente GCaMP6m sotto un promotore del citomegalovirus (CMV)37,46. Le cellule trasfettate hanno un basso livello di fluorescenza verde basale, che aumenta in presenza di calcio. Le regioni di interesse sono specificate per monitorare i cambiamenti di fluorescenza durante la nostra manipolazione. Ciò consente di misurare fluttuazioni del calcio altamente localizzate spazialmente e temporalmente37,46. Per valutare la fusione e il rilascio delle vescicole sinaptiche, i neuroni maturi vengono caricati con colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche mentre vengono riciclati, riformati e ricaricati con neurotrasmettitori nelle cellule presinaptiche41,42,43,47,48. Gli attuali coloranti utilizzati a questo scopo etichettano le vescicole sinaptiche lungo i neuriti e sono usati come proxy per queste regioni in esperimenti di imaging dal vivo, come è stato dimostrato dalla co-colorazione del colorante stirilico e della sinaptotagmina di Kraszewski e colleghi49. Qui sono incluse immagini rappresentative di colorazioni simili che sono state eseguite (Figura 2A). Precedenti ricercatori hanno ampiamente utilizzato tali coloranti per riportare la dinamica delle vescicole sinaptiche alla giunzione neuromuscolare e ai neuroni dell’ippocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selezionando regioni puntiformi di vescicole cariche di colorante e monitorando le diminuzioni dell’intensità di fluorescenza dopo il rilascio delle vescicole, la capacità di trasmissione sinaptica funzionale e la dinamica temporale di rilascio possono essere studiate dopo la stimolazione43. Per entrambi i metodi, un mezzo contenente un’alta concentrazione di cloruro di potassio viene impiegato per depolarizzare le cellule per imitare l’attività neuronale. I parametri di imaging sono specificati per catturare intervalli inferiori al secondo che coprono una normalizzazione di base seguita dal nostro periodo di cattura della stimolazione. Le misure di fluorescenza in ogni punto temporale sono determinate, normalizzate sullo sfondo e quantificate nel periodo di tempo sperimentale. L’aumento della fluorescenza GCaMP6m mediato dall’afflusso di calcio o l’efficace diminuzione della fluorescenza dell’esocitosi delle vescicole sinaptiche styryl dye release può essere rilevata attraverso questa strategia. Di seguito sono descritti la configurazione metodologica dettagliata e i parametri per questi due protocolli e una discussione sui loro vantaggi e limiti.
Figura 1: Rendering visivo del processo generale del protocollo generale. (1) Isolare e coltivare i neuroni primari dei roditori in vitro fino al punto temporale di maturazione scelto. (2) Introdurre il DNA GCaMP o il colorante stirilico come reporter dell’attività sinaptica. (3) Impostare il paradigma di imaging utilizzando il microscopio confocale dotato di live-imaging e il software associato. Inizia il periodo di registrazione di base. (4) Mentre le cellule sono ancora in fase di acquisizione di immagini dal vivo, stimolare i neuroni attraverso un’elevata perfusione del bagno KCl. (5) Valutare le misurazioni dell’intensità di fluorescenza nel tempo per misurare i transitori di calcio o la fusione delle vescicole sinaptiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tre passaggi comuni a entrambi i metodi descritti sono di cruciale importanza per il successo sperimentale e risultati quantificabili. In primo luogo, la preparazione di un ACSF fresco prima di ogni ciclo di esperimenti è essenziale, seguendo le istruzioni allegate. In caso contrario, potrebbe impedire un’appropriata depolarizzazione neuronale. Un campione di neuroni di controllo non trattati dovrebbe essere costantemente testato prima della stimolazione di qualsiasi gruppo sperimentale per garantire una corretta depola…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare gli attuali ed ex membri del Jefferson Weinberg ALS Center per il feedback critico e i suggerimenti per l’ottimizzazione di queste tecniche e delle loro analisi. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti del NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 a D.T),del NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), della Muscular Dystrophy Association (D.T.), del Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), della fondazione Family Strong 4 ALS e della Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. e P.P).
20x air objective | Nikon | For imaging | |
40x oil immersion objective | Nikon | For imaging | |
B27 supplement | Thermo Scientific | 17504044 | Neuronal growth supplement |
BD Syringes without Needle, 50 mL | Thermo Scientific | 13-689-8 | Part of gravity perfusion assembly |
Biosafety cell culture hood | Baker | SterilGARD III SG403A | Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading |
b-Mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | For culturing and maintenance of neuronal cultures |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9418 | For preparing neuronal cultures |
Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | 223506 | Component of aCSF solutions |
Cell culture CO2 incubator | Thermo Scientific | 13-998-123 | For culturing and maintenance of neurons |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | For neuronal culture preparation |
Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti +A1R core | For fluorescence imaging |
CoolSNAP ES2 CCD camera | Photometrics | For image acquisition | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | Component of aCSF solutions |
DNase | Millipore Sigma | D5025 | For neuronal culture preparation |
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats | Charles river | 400SASSD | For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures |
FITC Filter cube | Nikon | 77032509 | For imaging Gcamp calcium transients |
FM4-64 styryl dye | Invitrogen | T13320 | For imaging synaptic vesicle release |
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) | CellVis | D35-10-1.5-N | For growth of neurons on imaging-compatible culture dish |
Glass Pasteur pipette | Grainger | 52NK56 | For preparing neuronal cultures |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Millipore Sigma | H6648 | For preparing neuronal cultures |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Component of aCSF solutions |
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) | For imaging. Please see recipes* | ||
horse serum | Millipore Sigma | H1138 | For culturing and maintenance of neurons |
Laminar flow dissection hood | NUAIRE | NU-301-630 | For preparing neuronal cultures |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | For preparing neuronal cultures |
Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Scientific | 11415064 | For preparing neuronal cultures |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Scientific | 21083027 | For preparing neuronal cultures |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Scientific | 25030149 | Neuronal culture supplement |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11668019 | For neuronal transfections |
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) | For imaging. Please see recipes* | ||
Magnesium chloride | Millipore Sigma | 208337 | Component of aCSF solutions |
Microsoft Excel | Microsoft | Software for data analysis/normalization | |
Nalgene Filter Units, 0.2 µm PES | Thermo Scientific | 565-0020 | Filter unit for aCSF solution |
Neurobasal medium | Thermo Scientific | 21103049 | For culturing and maintenance of neuronal cultures |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | Software for image capture and analysis | |
Nunc 15 mL Conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | For preparing neuronal culture and buffer solutions |
Nunc 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | For preparing neuronal culture and buffer solutions |
Optiprep | Millipore Sigma | D1556 | For preparing neuronal cultures |
Papain | Millipore Sigma | P4762 | For preparing neuronal cultures |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | To prevent bacterial contamination of neuronal cultures |
Perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | For exchange of aCSF |
Perfusion tubing | Cole-Parmer | UX-30526-14 | Part of gravity perfusion assembly |
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid | Addgene | 40754 | For imaging calcium transients |
Poly-D-lysine hydrobromide | Millipore Sigma | P7886 | Coating agent for glass bottom petri dishes |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P3911 | Component of aCSF solutions |
Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761 | Component of aCSF solutions |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888 | Component of aCSF solutions |
Stage Top Incubator | Tokai Hit | For incubation of live neurons during imaging period | |
TRITC Filter cube | Nikon | 77032809 | For imaging FM4-64 |
Trypsin Inhibitor | Millipore Sigma | T6414 | For preparing neuronal cultures |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | For preparing neuronal cultures |
Vibration Isolation table | New Port | VIP320X2430-135520 | Table/stand for microscope |