筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

実験室での筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデリングは、症例の80%以上が圧倒的に散発的な性質^{を持っている1}と、疾患の原因であることが知られている膨大な数の遺伝子変異2のために、他に類を見ないほど困難になっています²。それにもかかわらず、ALSのすべての症例は、完全なニューロン変性の前に、シナプス前運動ニューロンとシナプス後筋細胞との間に機能不全のコミュニケーションがあるという統一的な特徴を共有しています^3,4。臨床的には、患者が残りの上部および下部運動ニューロンの接続性を失うにつれて、それらは疾患全体にわたってニューロンの過興奮性および低興奮性の特徴を呈し⁵、⁶、⁷、^8、9、これらのシナプスへの複雑な根底にある分子変化を反映しており^、ALS研究者として理解しようとしている。

複数のトランスジェニックモデルが、SOD110、FUS11,12、C9orf7213、¹⁴、¹⁵、¹⁶、およびTDP4317,18,19を含むALS原因遺伝子変異の発現とともに神経筋接合部の劣化および解体が起こることを実証している。 シナプスブートン、脊椎密度、シナプス前/シナプス後組織の評価を含む形態学的評価を通じて。機構的には、1930年代にコール、ホジキン、ハクスリーの画期的な論文が発表されて以来、in vitro細胞培養または組織スライス調製物のいずれかにおいて、電気生理学的手法を通じてシナプス応答を評価することも可能であった²⁰。これらの戦略を通じて、ALSの多くのモデルはシナプス伝達欠損を実証している。例えば、TDP43の変異変異体は、NSC-34(脊髄x神経芽腫ハイブリッド細胞株34)の運動ニューロン様細胞²¹において発火頻度を増強し、活動電位閾値を低下させる。この同じ変異はまた、マウスモデルにおける行動運動欠損の発症前に神経筋接合部(NMJ)で機能不全のシナプス伝達を引き起こす²²。変異型FUS発現は、自発運動障害前のFUS-ALSのショウジョウバエモデルにおいてNMJにおけるシナプス伝達の減少をもたらすことが以前に示された¹¹。C9orf72増殖キャリアに由来する誘導多能性幹細胞を用いた最近の報告は、シナプス小胞の容易に放出可能なプールの減少を明らかにした²³。全体として、これらの研究や他の研究は、ALSの疾患関連モデルにおけるシナプスシグナル伝達の根底にあるメカニズムのより包括的な理解を構築することの重要性を強調しています。これは、ALSの病態生物学を理解し、患者のための潜在的な治療標的を開発する上で極めて重要である。

電流および電圧クランプ細胞の方法は、コンダクタンス、静止膜電位、および個々のシナプスの量子的含有量などの膜特性を決定する上で非常に貴重であった^20,24。しかし、電気生理学の重大な限界の1つは、それが技術的に困難であり、一度に単一のニューロンからの洞察しか提供しないことです。生細胞共焦点顕微鏡は、特異的蛍光プローブと相まって、ニューロンのシナプス伝達を時空間的に調査する機会を提供する^25,26,27。ニューロン興奮性の直接的な尺度ではないが、この蛍光アプローチは、シナプス機能の2つの分子相関、すなわちシナプス小胞放出およびシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の相対的測定を提供することができる。

活動電位がニューロンのシナプス前終末領域に到達すると、カルシウム一過性が誘発され、電気信号から神経伝達物質放出の過程への移行が容易になる²⁸。これらの領域に局在する電位依存性カルシウムチャネルは、カルシウムシグナル伝達を厳密に調節して、神経伝達物質放出の動態を調節する²⁹。カルシウム過渡現象の最初に報告された蛍光ベースの記録は、二波長指示薬Fura-2 AMまたは単一波長色素Fluo-3 AM30^、31、32のいずれかを使用して実施された。これらの色素は当時、大きな新しい洞察を提供していましたが、細胞内の非特異的な区画化、標識細胞からの能動的または受動的な色素損失、フォトブリーチング、長期間にわたって画像化された場合の毒性など、いくつかの制限に苦しんでいます³³。過去10年間で、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、様々な形態のニューロン活動を画像化するための主力製品となっている。これらの指標は、修飾蛍光タンパク質と、^Ca2+イオンの結合後に蛍光強度を急速に切り替えるカルシウムキレートタンパク質とを組み合わせる³⁴。これらの新しい指標の適用は広範であり、in vitroおよびin vivo設定の両方で細胞内カルシウム過渡現象の視覚化をはるかに容易にすることを可能にする。GCaMPとして知られるこれらの遺伝的にコードされたレポーターの1つのファミリーは、現在広く利用されている。これらの指標は、C末端カルモジュリンドメインを含み、続いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、N末端カルモジュリン結合領域によってキャップされている^35、36。カルモジュリンドメインへのカルシウム結合は、カルモジュリン結合領域との相互作用を誘発し、タンパク質全体の構造における立体構造変化およびGFP部分の蛍光の実質的な増加をもたらす^35,36。長年にわたり、このレポーターファミリーは、それぞれがわずかに異なる特性を有する特定の動態(低速、中速、および高速)を有する特定のカルシウム過渡現象について、異なる読み出しを可能にするために、いくつかの進化を遂げてきた^37,38。ここで、レポーターGcaMP6の使用が強調されており、これは、インビボおよびインビトロの両方のニューロンにおける単一活動電位および樹状カルシウム一過性を検出することが以前に示されている³⁷。

シナプス前領域のカルシウム一過性はシナプス小胞融合事象を誘発し、シナプスへの神経伝達物質放出を引き起こし、シナプス後細胞におけるシグナル伝達事象の開始を引き起こす^28,39。シナプス小胞は、細胞が恒常的に安定した細胞膜表面積および容易に放出可能な融合可能な膜結合小胞のプールを維持するので、急速に放出され、リサイクルされる⁴⁰。ここで使用されるスチリル色素は、脂質膜に対して親和性を有し、周囲の脂質環境の秩序に基づいてその発光特性を特異的に変化させる^41、42。したがって、これは、シナプス小胞のリサイクルを標識し、ニューロン刺激後に後に放出されるこれらの小胞のその後の追跡のための理想的なツールである^41,42。生成および最適化されたプロトコルは、Gaffieldらによって最初に記述された概念の適応であり、スチリル色素標識シナプス小胞穿刺を経時的に連続的に視覚化することを可能にする⁴¹。

ここでは、2つの関連する蛍光ベースの方法論が記載されており、シナプス伝達に関与する特定の細胞事象を確実に報告する。培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス前終末カルシウム流入およびシナプス小胞エキソサイトーシスのダイナミクスをプローブするためのプロトコルが定義されている。ここで、方法および代表的な結果は、これらの細胞型を用いた公表された研究があるように、インビトロモデル系として原発性げっ歯類皮質または運動ニューロンを使用することに焦点を当てている^43,44。しかし、これらの方法は、分化したヒトⁱ³皮質様ニューロン⁴⁵にも適用可能であり、現在、当研究室で進行中の実験では、両方のプロトコルでも成功しています。一般的なプロトコルは、図1に示すステップワイズ線形形式で概説されています。要するに、神経突起におけるカルシウム動態を研究するために、成熟ニューロンをプラスミドDNAでトランスフェクトし、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下で蛍光レポーターGCaMP6mを発現させる^37、46。トランスフェクトされた細胞は、低レベルの基底緑色蛍光を有し、カルシウムの存在下で増加する。関心領域は、我々の操作全体を通して蛍光変化を監視するために指定される。これにより、カルシウムの高度に空間的および時間的に局在する変動を測定することができます^37,46。シナプス小胞の融合と放出を評価するために、成熟ニューロンはシナプス前細胞で神経伝達物質でリサイクルされ、改質され、リロードされるにつれてシナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素をロードされる^{41,42,43,47,48}。この目的のために使用されている現在の色素は、神経突起に沿ってシナプス小胞を標識し、Kraszewskiらによるスチリル色素とシナプトタグミンの共染色によって示されたように、ライブイメージング実験においてこれらの領域の代理として使用されている⁴⁹。ここにも実施された同様の染色の代表的な画像が含まれる(図2A)。これまでの研究者らは、神経筋接合部および海馬ニューロンにおけるシナプス小胞ダイナミクスを報告するために、このような色素を広範囲に使用してきた48,49,50,51,52,53,54,55,56.色素を負荷した小胞の点状領域を選択し、小胞放出後の蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、刺激後の機能的シナプス伝達能力および放出の時間的ダイナミクスを研究することができる⁴³。両方の方法において、高濃度の塩化カリウムを含む培地が使用され、細胞を脱分極させてニューロン活性を模倣する。イメージングパラメータは、ベースライン正規化とそれに続く刺激キャプチャ期間にまたがる1秒未満の間隔をキャプチャするように指定されます。各時点での蛍光測定値が決定され、バックグラウンドに正規化され、実験期間にわたって定量化されます。カルシウム流入媒介性GCaMP6m蛍光増加または効果的なシナプス小胞エキソサイトーシスチリル色素放出蛍光減少は、この戦略を通して検出することができる。これら2つのプロトコルの詳細な方法論的セットアップとパラメータ、およびそれらの利点と制限事項に関する議論については、以下で説明します。

図 1: 一般的なプロトコル プロセス全体の視覚的レンダリング。 (1)初代げっ歯類ニューロンを単離し、選択した成熟時点まで インビトロで 培養する。(2)シナプス活性のレポーターとしてGCaMP DNAまたはスチリル色素を導入する。(3)ライブイメージング搭載共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを用いたイメージングパラダイムの設定ベースライン記録期間を開始します。(4)細胞がまだライブ画像キャプチャを受けている間、高いKCl浴灌流を介してニューロンを刺激する。(5)蛍光強度測定値を経時的に評価し、カルシウム過渡現象またはシナプス小胞融合を測定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。