قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري
Summary
يتم وصف طريقتين مرتبطتين لتصور الأحداث تحت الخلوية المطلوبة للانتقال المشبكي. تمكن هذه البروتوكولات من المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الكالسيوم قبل المشبكي واندماج غشاء الحويصلة المشبكية باستخدام تصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المستزرعة في المختبر .
Abstract
قبل التنكس العصبي ، فإن سبب العجز الحركي والمعرفي في المرضى الذين يعانون من التصلب الجانبي الضموري (ALS) و / أو خرف الفص الجبهي الصدغي (FTLD) هو خلل في التواصل بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية الحركية والعضلات. تتضمن العملية الأساسية للانتقال المشبكي دمج الحويصلة المشبكية المعتمدة على إزالة الاستقطاب الغشائي وإطلاق الناقلات العصبية في المشبك. تحدث هذه العملية من خلال تدفق الكالسيوم الموضعي إلى المحطات الطرفية قبل المشبكي حيث توجد الحويصلات المتشابكة. هنا ، يصف البروتوكول منهجيات التصوير الحي القائمة على التألق التي تبلغ بشكل موثوق عن إفراز الحويصلة المشبكية بوساطة إزالة الاستقطاب وديناميكيات تدفق الكالسيوم الطرفية قبل المشبكية في الخلايا العصبية المستزرعة.
باستخدام صبغة ستايريل التي يتم دمجها في أغشية الحويصلة المشبكية ، يتم توضيح إطلاق الحويصلة المتشابكة. من ناحية أخرى ، لدراسة دخول الكالسيوم ، يتم استخدام Gcamp6m ، وهو مراسل فلورسنت مشفر وراثيا. نحن نستخدم إزالة الاستقطاب بوساطة كلوريد البوتاسيوم العالية لتقليد النشاط العصبي. لتحديد كمية إفرازات الحويصلة المشبكية بشكل لا لبس فيه ، نقيس فقدان تألق صبغة الستيريل الطبيعية كدالة للوقت. في ظل ظروف تحفيز مماثلة ، في حالة تدفق الكالسيوم ، يزداد التألق Gcamp6m. يتم إجراء التطبيع والقياس الكمي لهذا التغيير الفلوري بطريقة مماثلة لبروتوكول صبغة الستاريل. يمكن مضاعفة هذه الطرق مع الإفراط في التعبير القائم على النقل للبروتينات الطافرة الموسومة بالفلورسنت. وقد استخدمت هذه البروتوكولات على نطاق واسع لدراسة الخلل الوظيفي المتشابك في نماذج من FUS-ALS و C9ORF72-ALS ، باستخدام الخلايا العصبية القشرية والحركية للقوارض الأولية. تسمح هذه البروتوكولات بسهولة بالفحص السريع للمركبات التي قد تحسن التواصل العصبي. على هذا النحو ، فإن هذه الأساليب ذات قيمة ليس فقط لدراسة ALS ولكن لجميع مجالات أبحاث علم الأعصاب التنكسية العصبية والتنموية.
Introduction
إن نمذجة التصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر تشكل تحديا فريدا بسبب الطبيعة المتفرقة بشكل ساحق لأكثر من 80٪ من الحالات1، إلى جانب العدد الهائل من الطفرات الجينية المعروفة بأنها مسببة للأمراض2. على الرغم من ذلك ، تشترك جميع حالات ALS في ميزة موحدة مفادها أنه قبل التنكس العصبي الصريح ، هناك اتصال مختل وظيفيا بين الخلايا العصبية الحركية قبل المشبكي وخلايا العضلات بعد المشبكي 3,4. سريريا ، عندما يفقد المرضى اتصال الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية المتبقية ، فإنهم يقدمون ميزات فرط الخلايا العصبية ونقص الاستثارة طوال المرض5،6،7،8،9 ، مما يعكس التغيرات الجزيئية الكامنة المعقدة لهذه المشابك العصبية ، والتي نسعى ، كباحثين في ALS ، إلى فهمها.
وقد أوضحت نماذج متعددة معدلة وراثيا أن تدهور وتفكك الوصلة العصبية العضلية يحدث مع التعبير عن الطفرات الجينية المسببة ل ALS ، بما في ذلك SOD110 و FUS11,12 و C9orf7213,14,15,16 و TDP4317,18,19 من خلال التقييمات المورفولوجية ، بما في ذلك تقييم البوتونات المشبكية ، وكثافات العمود الفقري ، والتنظيم قبل / بعد المشبكية . ميكانيكيا ، منذ الأوراق التاريخية لكول وهودجكين وهكسلي في 1930s ، كان من الممكن أيضا تقييم الاستجابات المشبكية من خلال التقنيات الكهروفسيولوجية إما في زراعة الخلايا المختبرية أو مستحضرات شرائح الأنسجة20. من خلال هذه الاستراتيجيات ، أظهرت العديد من نماذج ALS عجزا في الانتقال المتشابك. على سبيل المثال، يتسبب متغير متحور من TDP43 في تحسين تردد إطلاق النار ويقلل من عتبة العمل المحتملة في NSC-34 (الحبل الشوكي × خط الخلايا الهجينة للورم الأرومي العصبي 34) الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية الحركية21. هذا المتغير نفسه يسبب أيضا انتقال متشابك مختل وظيفيا عند التقاطع العصبي العضلي (NMJ) قبل بداية العجز الحركي السلوكي في نموذج الفأر22. وقد تبين سابقا أن تعبير FUS المتحور يؤدي إلى انخفاض الانتقال المشبكي في NMJ في نموذج ذبابة الفاكهة من FUS-ALS قبل العيوب الحركية11. كشف تقرير حديث يستخدم الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من ناقلات التوسع C9orf72 عن انخفاض في مجموعة الحويصلات المشبكية القابلة للنشر بسهولة23. وإجمالا، تسلط هذه الدراسات وغيرها الضوء على أهمية بناء فهم أكثر شمولا للآليات الكامنة وراء الإشارات المشبكية في النماذج ذات الصلة بالأمراض من مرض التصلب الجانبي الضموري. سيكون هذا محوريا في فهم البيولوجيا المرضية ل ALS وتطوير أهداف علاجية محتملة للمرضى.
كانت طرق خلايا تثبيت التيار والجهد لا تقدر بثمن في تحديد خصائص الغشاء مثل التوصيل ، وإمكانات غشاء الراحة ، والمحتوى الكمي للمشابك الفردية 20،24. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المهمة للفيزيولوجيا الكهربية هو أنه يمثل تحديا تقنيا ويوفر فقط رؤى من خلية عصبية واحدة في كل مرة. يوفر المجهر البؤري للخلايا الحية ، إلى جانب تحقيقات فلورية محددة ، الفرصة للتحقيق في الانتقال المتشابك للخلايا العصبية بطريقة مكانية زمانية 25،26،27. على الرغم من أنه ليس مقياسا مباشرا للاستثارة العصبية ، إلا أن نهج التألق هذا يمكن أن يوفر قياسا نسبيا لاثنين من الارتباطات الجزيئية للوظيفة المتشابكة: إطلاق الحويصلة المشبكية وانتقالات الكالسيوم في المحطات المتشابكة.
عندما يصل جهد العمل إلى المنطقة الطرفية قبل المشبكي للخلايا العصبية، يتم تشغيل انتقالات الكالسيوم، مما يسهل الانتقال من إشارة كهربائية إلى عملية إطلاق الناقل العصبي28. تنظم قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد المترجمة إلى هذه المناطق إشارات الكالسيوم بإحكام لتعديل حركية إطلاق الناقل العصبي29. تم إجراء أول تسجيلات قائمة على التألق لعابرات الكالسيوم باستخدام مؤشر الطول الموجي المزدوج Fura-2 AM أو صبغة الطول الموجي الواحد Fluo-3 AM30,31,32. في حين أن هذه الأصباغ قدمت رؤية جديدة كبيرة في ذلك الوقت، إلا أنها تعاني من العديد من القيود مثل التقسيم غير المحدد داخل الخلايا، وفقدان الصبغة النشطة أو السلبية من الخلايا الموسومة، والتبييض الضوئي، والسمية إذا تم تصويرها على مدى فترات طويلة من الزمن33. في العقد الماضي ، أصبحت مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا هي العمود الفقري لتصوير أشكال مختلفة من النشاط العصبي. تجمع هذه المؤشرات بين بروتين الفلورسنت المعدل وبروتين مخلب الكالسيوم الذي يغير بسرعة شدة التألق بعد ربط أيونات Ca2+ 34. تطبيق هذه المؤشرات الجديدة واسع النطاق ، مما يسمح بتصور أسهل بكثير لعابرات الكالسيوم داخل الخلايا سواء في المختبر أو في إعدادات الجسم الحي. عائلة واحدة من هؤلاء المراسلين المشفرين وراثيا ، والمعروفة باسم GCaMP ، تستخدم الآن على نطاق واسع. تحتوي هذه المؤشرات على مجال كالمودولين C-terminal ، يليه بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، ويتم تغطيتها بمنطقة ربط الكالمودولين الطرفية N-terminal 35,36. يؤدي ربط الكالسيوم بمجال الكالمودولين إلى تفاعل مع منطقة ربط الكالمودولين ، مما يؤدي إلى تغيير مطابق في بنية البروتين الكلية وزيادة كبيرة في تألق GFP moiety35,36. على مر السنين ، خضعت هذه العائلة من المراسلين للعديد من التطورات لتمكين قراءات متميزة لعابرات الكالسيوم الخاصة ذات الحركيات المحددة (البطيئة والمتوسطة والسريعة) ، ولكل منها خصائص مختلفة قليلا37،38. هنا ، تم تسليط الضوء على استخدام المراسل GcaMP6 ، والذي ثبت سابقا أنه يكتشف إمكانات العمل الفردي وانتقالات الكالسيوم المتغصنة في الخلايا العصبية في كل من الجسم الحي والمختبر 37.
تؤدي انتقالات الكالسيوم في المنطقة قبل المشبكي إلى أحداث اندماج الحويصلة المشبكية ، مما يتسبب في إطلاق الناقل العصبي في المشبك العصبي وبدء أحداث الإشارات في الخلية ما بعد المشبكية28,39. يتم إطلاق الحويصلات المشبكية بسرعة وإعادة تدويرها، حيث تحافظ الخلية بشكل متجانس على مساحة سطح غشاء خلية مستقرة ومجموعة قابلة للنشر بسهولة من الحويصلات المرتبطة بالغشاء القادرة على الانصهار40. صبغة الستيريل المستخدمة هنا لها تقارب تجاه الأغشية الدهنية وتغير على وجه التحديد خصائص انبعاثاتها بناء على ترتيب البيئة الدهنية المحيطة41,42. وبالتالي ، فهي أداة مثالية لوضع العلامات على إعادة تدوير الحويصلات المشبكية والتتبع اللاحق لهذه الحويصلات حيث يتم إطلاقها لاحقا بعد التحفيز العصبي41,42. البروتوكول الذي تم إنشاؤه وتحسينه هو تكييف للمفاهيم التي وصفها غافيلد وزملاؤه في البداية ، مما يسمح لنا بتصور ثقب الحويصلة المشبكية المسمى بصبغة الستايريل بمرور الوقت بشكل مستمر41.
هنا ، يتم وصف منهجيتين قائمتين على التألق ، حيث يتم الإبلاغ بشكل موثوق عن أحداث خلوية محددة تشارك في الانتقال المشبكي. تم تعريف البروتوكولات للتحقيق في ديناميكيات تدفق الكالسيوم الطرفي قبل المشبكي بوساطة إزالة الاستقطاب وإفراز الحويصلة المشبكية في الخلايا العصبية المستزرعة. هنا ، تركز الطرق والنتائج التمثيلية على استخدام الخلايا العصبية القشرية أو الحركية الأولية للقوارض كنظام نموذج في المختبر ، حيث توجد دراسات منشورة باستخدام أنواع الخلايا هذه43,44. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق قابلة للتطبيق أيضا على الخلايا العصبية البشرية المتباينة i3 الشبيهة بالقشرية 45 ، حيث حققنا أيضا نجاحا مع كلا البروتوكولين في التجارب الجارية حاليا في مختبرنا. يتم تحديد البروتوكول العام في شكل خطي تدريجي ، كما هو موضح في الشكل 1. باختصار ، لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية ، يتم نقل الخلايا العصبية الناضجة باستخدام الحمض النووي البلازميدي للتعبير عن مراسل الفلورسنت GCaMP6m تحت مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) 37,46. تحتوي الخلايا المنقولة على مستوى منخفض من التألق الأخضر القاعدي ، والذي يزداد في وجود الكالسيوم. يتم تحديد المناطق ذات الأهمية لمراقبة تغيرات التألق طوال فترة تلاعبنا. وهذا يسمح بقياس التقلبات المكانية والزمانية العالية في الكالسيوم37,46. لتقييم اندماج الحويصلة المشبكية وإطلاقها ، يتم تحميل الخلايا العصبية الناضجة بصبغة الستيريل المدمجة في أغشية الحويصلة المشبكية أثناء إعادة تدويرها وإصلاحها وإعادة تحميلها بالناقلات العصبية في الخلايا قبل المشبكية 41،42،43،47،48. الأصباغ الحالية المستخدمة لهذا الغرض تسمية الحويصلات المشبكية على طول الخلايا العصبية وتستخدم كوكيل لهذه المناطق في تجارب التصوير الحي ، كما هو موضح من خلال التلطيخ المشترك لصبغة الستايريل و synaptotagmin من قبل Kraszewski وزملاؤه49. تتضمن هنا صورا تمثيلية لتلطيخ مماثل تم إجراؤه أيضا (الشكل 2A). استخدم الباحثون السابقون هذه الأصباغ على نطاق واسع للإبلاغ عن ديناميكيات الحويصلة المشبكية عند التقاطع العصبي العضلي والخلايا العصبية الحصينية48,49,50,50,51,52,53,54,55,56 . ومن خلال اختيار المناطق المثقوبة من الحويصلات المحملة بالصبغة ورصد الانخفاضات في شدة التألق بعد إطلاق الحويصلة، يمكن دراسة قدرة الإرسال المتشابك الوظيفي والديناميات الزمنية للإطلاق بعد التحفيز43. بالنسبة لكلتا الطريقتين ، يتم استخدام وسط يحتوي على تركيز عال من كلوريد البوتاسيوم لإزالة استقطاب الخلايا لمحاكاة النشاط العصبي. يتم تحديد معلمات التصوير لالتقاط فترات دون الثانية تمتد عبر تطبيع خط الأساس تليها فترة التقاط التحفيز لدينا. يتم تحديد قياسات التألق في كل نقطة زمنية ، وتطبيعها في الخلفية ، وتحديدها كميا خلال الفترة الزمنية التجريبية. يمكن الكشف عن زيادة التألق بوساطة تدفق الكالسيوم GCaMP6m أو انخفاض التألق الفعال في الحويصلة الخارجية المشبكية لإخراج صبغة الستايريل من خلال هذه الاستراتيجية. ويرد أدناه وصف للإعداد المنهجي التفصيلي وبارامترات هذين البروتوكولين ومناقشة بشأن مزاياهما وقيودهما.
الشكل 1: العرض المرئي لعملية البروتوكول العامة الشاملة. (1) عزل وزراعة الخلايا العصبية القوارض الأولية في المختبر إلى نقطة النضج المختارة. (2) إدخال الحمض النووي GCaMP أو صبغة الستيريل كمراسلين للنشاط المشبكي. (3) إعداد نموذج التصوير باستخدام المجهر البؤري المجهز بالتصوير الحي والبرامج المرتبطة به. ابدأ فترة تسجيل خط الأساس. (4) بينما لا تزال الخلايا تخضع لالتقاط الصور الحية ، قم بتحفيز الخلايا العصبية عن طريق تروية حمام KCl عالية. (5) تقييم قياسات شدة التألق بمرور الوقت لقياس انتقالات الكالسيوم أو اندماج الحويصلة المتشابكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك ثلاث خطوات مشتركة بين كلتا الطريقتين الموصوفتين ذات أهمية حاسمة للنجاح التجريبي والنتائج القابلة للقياس الكمي. أولا ، يعد إعداد aCSF الطازج قبل كل جولة من التجارب أمرا ضروريا ، باتباع التعليمات المرفقة. الفشل في القيام بذلك قد يمنع إزالة الاستقطاب العصبي المناسب. يجب اختبار عينة من ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشيد بالأعضاء الحاليين والسابقين في مركز جيفرسون واينبرغ ALS للحصول على تعليقات واقتراحات نقدية لتحسين هذه التقنيات وتحليلاتها. تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (RF1-AG057882-01 و R21-NS0103118 إلى D.T) ، و NINDS (R56-NS092572 و R01-NS109150 إلى P.P) ، وجمعية ضمور العضلات (D.T.) ، ومركز روبرت باكارد لأبحاث ALS (D.T.) ، ومؤسسة Family Strong 4 ALS ومؤسسة Farber Family Foundation (B.K.J. ، K.K ، و P.P).
Materials
| 20x air objective | Nikon | For imaging | |
| 40x oil immersion objective | Nikon | For imaging | |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504044 | Neuronal growth supplement |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Thermo Scientific | 13-689-8 | Part of gravity perfusion assembly |
| Biosafety cell culture hood | Baker | SterilGARD III SG403A | Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading |
| b-Mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | For culturing and maintenance of neuronal cultures |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9418 | For preparing neuronal cultures |
| Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | 223506 | Component of aCSF solutions |
| Cell culture CO2 incubator | Thermo Scientific | 13-998-123 | For culturing and maintenance of neurons |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | For neuronal culture preparation |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti +A1R core | For fluorescence imaging |
| CoolSNAP ES2 CCD camera | Photometrics | For image acquisition | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | Component of aCSF solutions |
| DNase | Millipore Sigma | D5025 | For neuronal culture preparation |
| Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats | Charles river | 400SASSD | For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures |
| FITC Filter cube | Nikon | 77032509 | For imaging Gcamp calcium transients |
| FM4-64 styryl dye | Invitrogen | T13320 | For imaging synaptic vesicle release |
| Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) | CellVis | D35-10-1.5-N | For growth of neurons on imaging-compatible culture dish |
| Glass Pasteur pipette | Grainger | 52NK56 | For preparing neuronal cultures |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Millipore Sigma | H6648 | For preparing neuronal cultures |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Component of aCSF solutions |
| High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) | For imaging. Please see recipes* | ||
| horse serum | Millipore Sigma | H1138 | For culturing and maintenance of neurons |
| Laminar flow dissection hood | NUAIRE | NU-301-630 | For preparing neuronal cultures |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | For preparing neuronal cultures |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Scientific | 11415064 | For preparing neuronal cultures |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Scientific | 21083027 | For preparing neuronal cultures |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Scientific | 25030149 | Neuronal culture supplement |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11668019 | For neuronal transfections |
| Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) | For imaging. Please see recipes* | ||
| Magnesium chloride | Millipore Sigma | 208337 | Component of aCSF solutions |
| Microsoft Excel | Microsoft | Software for data analysis/normalization | |
| Nalgene Filter Units, 0.2 µm PES | Thermo Scientific | 565-0020 | Filter unit for aCSF solution |
| Neurobasal medium | Thermo Scientific | 21103049 | For culturing and maintenance of neuronal cultures |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | Software for image capture and analysis | |
| Nunc 15 mL Conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | For preparing neuronal culture and buffer solutions |
| Nunc 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | For preparing neuronal culture and buffer solutions |
| Optiprep | Millipore Sigma | D1556 | For preparing neuronal cultures |
| Papain | Millipore Sigma | P4762 | For preparing neuronal cultures |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | To prevent bacterial contamination of neuronal cultures |
| Perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | For exchange of aCSF |
| Perfusion tubing | Cole-Parmer | UX-30526-14 | Part of gravity perfusion assembly |
| pGP-CMV-Gcamp6m plasmid | Addgene | 40754 | For imaging calcium transients |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Millipore Sigma | P7886 | Coating agent for glass bottom petri dishes |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P3911 | Component of aCSF solutions |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761 | Component of aCSF solutions |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888 | Component of aCSF solutions |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | For incubation of live neurons during imaging period | |
| TRITC Filter cube | Nikon | 77032809 | For imaging FM4-64 |
| Trypsin Inhibitor | Millipore Sigma | T6414 | For preparing neuronal cultures |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | For preparing neuronal cultures |
| Vibration Isolation table | New Port | VIP320X2430-135520 | Table/stand for microscope |
References
- Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
- Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
- Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
- Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
- Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
- Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
- Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, 1540-1550 (2008).
- Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
- Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
- Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
- Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
- Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
- Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
- Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
- Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
- Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
- Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
- Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle’s loop. American Journal of Physiology. 268 (6), 1148-1153 (1995).
- Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
- Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
- Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
- Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
- Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
- Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
- Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
- Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
- Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
- Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
- Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
- Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
- Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
- Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
- Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
- Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
- Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
- Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).
