Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca²⁺-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET

La transferencia de energía por resonancia de Föster (FRET) se ha convertido en una técnica estándar para determinar la distancia entre las estructuras moleculares después de la unión o interacción en los estudios de estructura y función de^{proteínas 1,2,3,4}. En las ATPasas de tipo P, FRET se ha utilizado para investigar la estructura y función del retículo sarco-endoplásmico Ca²⁺-ATPasa (SERCA)^2,5,6,7,8,por ejemplo, las fluctuaciones estructurales durante el ciclo catalítico se han analizado en toda la proteína mediante FRET^7.

Los donantes de FRET son diversos, y van desde pequeñas moléculas fluorescentes (extrínsecas) hasta proteínas fluorescentes^9,10. Los residuos de triptófano (Trp) (debido a su fluorescencia) son útiles para identificar cambios estructurales en las secuencias de aminoácidos proteicos^11,12. La intensidad de fluorescencia de Trp depende sustancialmente de la polaridad de su entorno circundante^13,14. La unión a ligando suele generar reordenamientos estructurales en proteínas/enzimas^15,16. Si Trp está presente o cerca del sitio de unión a la proteína, las fluctuaciones estructurales afectan con frecuencia el grado de exposición de Trp a los medios acuosos^13,14; por lo tanto, el cambio en la polaridad resulta en el enfriamiento de la intensidad de fluorescencia Trp^13,14. Por lo tanto, la propiedad fluorescente de Trp es útil para realizar estudios de unión a ligandos para enzimas. Otros fenómenos físicos también pueden conducir a un enfriamiento de fluorescencia de Trp^17,18,19,20, por ejemplo, FRET y cambios en la polaridad media. La transferencia de energía del estado excitado de Trp a un fluoróforo también tiene aplicaciones potenciales, por ejemplo, la determinación de afinidad de pequeños ligandos en proteínas²¹. De hecho, Trp se ha utilizado principalmente como donante de fluorescencia en estudios FRET en proteínas^22,23,24,por ejemplo, en estudios FRET de terbio (Tb^3+),un residuo de Trp se utiliza con frecuencia como antena para la transferencia de energía a Tb^3+25,26,27. Trp muestra diversas ventajas sobre otros donantes de FRET debido a su carácter constitutivo inherente en la estructura de la proteína, lo que elimina la necesidad de procesos preparatorios que pueden afectar la función/estructura de la proteína estudiada²⁴. Por lo tanto, la identificación de desintegraciones radiativas (transferencia de energía y cambios en la polaridad media que son inducidos por reordenamientos estructurales de proteínas) es importante para sacar conclusiones precisas con respecto a la unión a ligandos en estudios estructurales de proteínas^13,14,19,28.

En estudios estructurales de proteínas, un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se ha utilizado principalmente en experimentos relacionados con el plegamiento / despliegue de proteínas^28,29. El SNA se une a proteínas/enzimas en estado nativo, generalmente en los sitios de unión de los sustratos^31,32,33; un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia ANS (ΦF) (es decir, un aumento en la intensidad de fluorescencia) es inducido por excitar la proteína a λ = 370 nm cuando se producen interacciones adecuadas de ANS con Arg y sus residuos en bolsas hidrofóbicas^34,35,36,37. En diversos estudios, se ha notificado la aparición de FRET (cuando se excita a λ dentro de 280-295 nm) entre los residuos de Trp (donantes) y ANS (aceptor), que se basa en lo siguiente: 1) superposición del espectro de emisión de fluorescencia de Trp y espectro de excitación de ANS, 2) identificación de una distancia adecuada entre uno o más residuos de Trp y ANS para la transferencia de energía, 3) alto rendimiento cuántico de ANS cuando se une en bolsas de proteínas, y 4) patrón FRET característico en los espectros de fluorescencia de la proteína en presencia de ANS^{3,17,27,37,38.}

Recientemente, la unión de ligandos al dominio de unión a nucleótidos (dominio N) en SERCA y otras ATPasas de tipo P se han investigado utilizando dominios N recombinantes^{diseñados 40,41,42,43,44,45,46.} La ingeniería molecular del dominio SERCA N se ha utilizado para mover el único residuo de Trp (Trp552Leu) a una estructura más dinámica (Tyr587Trp) que está cerca del sitio de unión a nucleótidos, donde las variaciones de fluorescencia (enfriamiento) se pueden utilizar para monitorear los cambios estructurales en la unión del ligando³⁴. Los resultados experimentales han demostrado que el SNA se une (como ATP) al sitio de unión a nucleótidos en el dominio SERCA N recombinante purificado^34. Curiosamente, la fluorescencia ans aumenta al unirse al dominio N tras la excitación a una λ de 295 nm, mientras que la fluorescencia intrínseca del dominio N disminuye^34,produciendo así un patrón FRET que sugiere la formación de un par Trp-ANS FRET.

Se ha propuesto el uso de NBS para determinar el contenido de residuos de Trp en proteínas^{47 mediante} ensayo de absorbancia de proteínas modificadas. NBS modifica el grupo indol altamente absorbente de Trp al oxindole menos absorbente^47,48. Esto resulta en la pérdida (enfriamiento) de la propiedad fluorescente Trp⁴⁰. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS de los residuos de Trp se puede utilizar como un ensayo para definir el papel de Trp (como donante) cuando se hipotetiza FRET.

Este protocolo describe la modificación química del único residuo de Trp por NBS en el dominio N recombinante diseñado de SERCA como un modelo de proteína. Los resultados experimentales demuestran que la intensidad de la fluorescencia del SÁN sigue aumentando en el dominio N³⁴modificado químicamente por NBS, que carece de fluorescencia intrínseca. Por lo tanto, el ensayo es útil para demostrar la ausencia de FRET entre el residuo de Trp y anS cuando se une al dominio N^34,40,49. Por lo tanto, este ensayo (modificación química NBS de Trp) es útil para probar la presencia del par Trp-ANS FRET en las proteínas.